組織（小鼠十二指腸）蛋白提取

1.???? 準(zhǔn)備: 研磨珠、離心管、生理鹽水、RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑，磷酸化蛋白酶抑制劑，移液槍，槍頭，手套，冰，渦旋儀，4℃離心機;

在RIPA蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑（根據(jù)說明書確定加入量）

2.???? 研磨: 提前在離心管中分裝300μL RIPA蛋白裂解液并放入2顆研磨珠，稱取100mg左右樣品，置于勻漿機中充分研磨;

3.???? 蛋白裂解: 將樣品置于冰上裂解2h, 期間于渦旋振蕩器上震蕩2-3次;

4.???? 蛋白收集: 將裂解后的樣品4℃ 12000rpm離心10min，取上清置于新的EP管中備用。

蛋白質(zhì)濃度檢測及制樣

1.???? 準(zhǔn)備: BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒(碧云天)，96孔板，生理鹽水；

2.???? 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備(3個重復(fù))：

完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為2 mg/mL(生理鹽水稀釋)

3.???? BCA工作液配制：

根據(jù)樣品數(shù)量，試劑A:試劑B=50:1配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。

4.???? 將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（生理鹽水）補足到20μL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml;

5.???? 樣品稀釋：根據(jù)預(yù)實驗摸索樣品的最佳稀釋倍數(shù)，取稀釋后的樣品20μL加到96孔板中;

6.???? 向各孔中加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30min (也可以室溫放置2小時，或60℃放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時間)。

7.???? 用酶標(biāo)儀測定A562，或540-595nm之間的其他波長的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積及稀釋倍數(shù)計算出樣品的蛋白濃度。

Western Blot

1.???? 電泳樣品準(zhǔn)備，每個樣品總蛋白上20-40μg，計算各個樣品所需取樣量，并與5×loading buffer混勻至300μL，沸水煮10 min(使用封口膜封住管口以免爆炸)，放入冰盒中速冷，分裝4份，-80℃保存; 剩余的母液可保存于-80℃，以便下次制樣;

2.???? SDS-PAGE凝膠配制(SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒,生工)

a.根據(jù)蛋白分子大小，確定制膠濃度濃度。

3.???? 電泳：

a. 將電泳液倒入電泳槽，玻璃板夾在電泳架上，按照電泳正負(fù)極標(biāo)識對應(yīng)放入電泳槽內(nèi)，使電泳液沒過膠板下沿，并將膠板內(nèi)部倒入新配的電泳液，沒過膠板上沿，使整個膠板接觸電泳液，垂直拔掉梳子防止膠孔破損變形。

b. 點樣： 第一塊膠的第一個孔點入maker，剩余孔點入10 -20μL樣品。快速上樣，防止蛋白分子擴散。每個樣品的每種蛋白一般做3-4個平行，將大分子量的蛋白與小分子量蛋白可跑同一板膠，相近的蛋白分子量于不同板上跑膠。

c. 對應(yīng)正負(fù)極，蓋上蓋子并插好電源線，打開電源，設(shè)定電壓70V，開始電泳約1h后，樣品跑到分離膠后加大電壓至90-120V，繼續(xù)電泳，根據(jù)不同的目的蛋白分子量，參考maker的位置調(diào)整電泳時間。

4.???? 轉(zhuǎn)膜：

a. 切膠，用切膠板切除濃縮膠，根據(jù)maker確定目的蛋白分子量位置切膠，將膠板在電轉(zhuǎn)緩沖液中潤濕。

b. 根據(jù)濾紙大小裁剪PVDF膜，在甲醇中浸泡5-10min

c. 將海綿和濾紙在電轉(zhuǎn)液中浸透，在電轉(zhuǎn)夾子中按照（黑面，一片海綿，三層濾紙，膠，膜，三層濾紙，一片海綿，白面）的順序鋪平，每放一層用滾子趕走氣泡（注意不要使兩端濾紙接觸造成短路，因而濾紙的大小必須小于PVDF膜的大?。?，且在整個過程中要防止膜與膠變干。夾好轉(zhuǎn)膜夾，插入電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，側(cè)面放入冰盒，注滿電轉(zhuǎn)緩沖液，按正負(fù)極標(biāo)注插入電源，調(diào)至180mA并根據(jù)目的蛋白的大小設(shè)定轉(zhuǎn)膜時間，冰上轉(zhuǎn)膜。

5.???? 封閉

取出膜，剪裁后按照接觸膠面為正面放入孵育盒，用TBST稍洗一次，加入5%脫脂奶粉（1.5g脫脂奶粉+30mlTBST），搖床上封閉2h。

6.???? 一抗孵育

a. 將脫脂奶粉吸出（切勿觸碰到膜），加入TBST清洗一次，根據(jù)一抗的稀釋比例加入一抗稀釋液（牛血清白蛋白）和抗體（注意一定要使膜完全被稀釋液浸泡，以防止膜干），搖床孵育30min，4℃靜置過夜。

b. 吸出孵育盒中的一抗回收于離心管中，標(biāo)記抗體名稱，回收時間，-20℃保存。

c. TBST洗膜4次，每次在脫色搖床上洗8-10min。

7.???? 二抗孵育

a. 5%脫脂奶粉和二抗按1:500（4mL+0.8μL）加入孵育盒，沒過膜，搖床孵育2h。

b. TBST洗膜4次，每次在脫色搖床上洗10min

8.???? 顯色

等體積混合BeyoECL Star A液和B液，室溫放置備用。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。用平頭鑷子將膜取出，用吸水紙吸去多余液體，切勿接觸蛋白面，然后置于保鮮膜上。根據(jù)膜的大小，按照每10cm2膜加1mL BeyoECL Star工作液，使工作液均勻覆蓋在膜上，放置2-3min，取膜棄去工作液，用吸水紙吸去過多液體，將膜放在兩層保鮮膜中間，進(jìn)行熒光檢測。

將膜放入機箱內(nèi)，設(shè)置化學(xué)發(fā)光，設(shè)置連續(xù)曝光五張，時間為10s，20s，30s，40s，50s開始拍攝。篩選并調(diào)整拍攝的圖片，保存。分析試驗結(jié)果。