Nature Methods丨大咖組團發(fā)表環(huán)狀RNA檢測工具的評估報告以及使用指南
概述
2023年7月13日，OncoRNALab聯(lián)合了眾多國際知名環(huán)狀RNA研究大咖在Nature Methods(IF=48.0)刊發(fā)了Large-scale benchmarking of circRNA detection tools reveals large differences in sensitivity but not in precision，研究團隊對二代測序環(huán)狀RNA檢測工具進行了標(biāo)準(zhǔn)化測試。
OncoRNALab由比利時根特大學(xué)的Jo Vandesompele和Pieter Mestdagh教授負(fù)責(zé)監(jiān)管，屬于根特醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中心和癌癥研究所的一部分。該實驗室的研究旨在利用RNA進行診斷和治療，目前大量研究集中于非編碼RNA在癌癥中的作用以及細(xì)胞外RNA在液體活檢中的應(yīng)用。該實驗室試圖通過高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)工具的結(jié)合來回答各種基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究的問題。
這篇文章很短，但是故事很長。
文章很短，文章只做了一件環(huán)狀RNA研究者都會做的事：對高通量測序檢測到的環(huán)狀RNA進行低通量驗證。
故事很長，本文聯(lián)合了環(huán)狀RNA領(lǐng)域的諸多大咖一起，通過3種低通量檢測方法對16個高通量circRNA檢測方法的精確性和敏感性等指標(biāo)進行了評估。而這16個工具，來自不同的時間、不同的研究小組，見證了環(huán)狀RNA領(lǐng)域的發(fā)展史；每一個工具的背后應(yīng)該都有一段故事——敘說了開發(fā)者對環(huán)狀RNA的認(rèn)知和期許。
文章對3種人類癌癥細(xì)胞系的total RNA進行了深度測序，通過16種知名的檢測工具識別到了315312個環(huán)狀RNA，隨后通過三種正交的低通量驗證方法：
qPCR
確定候選circRNA BSJ是否能夠被檢測到。
RNase R
證實所檢測到的RNA是環(huán)狀的而不是線性的。
amplicon sequencing
即PCR擴增后sanger測序，用于證實環(huán)狀RNA BSJ序列
對1516個預(yù)測的circRNAs進行了驗證。結(jié)果顯示，16種工具的準(zhǔn)確性中值達到了98.8%、96.3%和95.5%，然而這些工具的敏感性和預(yù)測數(shù)量差異巨大。
評估過程與部分結(jié)果
文章的發(fā)起者讓16個工具對應(yīng)的作者團隊利用自己的工具對3個深度測序的細(xì)胞系進行環(huán)狀RNA預(yù)測（如下圖）。
隨后，每個工具隨機挑選80個BSJ counts>=5以及20個BSJ counts<5共100個環(huán)狀RNA——總共1600個環(huán)狀RNA用于驗證。
一些環(huán)狀RNA引物存在脫靶風(fēng)險，將不被考慮用于驗證，剩余1560個分子。
同時由于偶然原因，不同的工具，不同的細(xì)胞系，相同的circRNA被選中，最后1516個circRNAs被用于最后的驗證。
每個工具具體的環(huán)狀RNA精確性（驗證率）如下圖
敏感性評估如下圖
敏感性和精確性的綜合評估
更詳細(xì)的結(jié)果請訪問原文：
https://doi.org/10.1038/s41592-023-01944-6
小知識
中肯的建議
該項研究表明，3種驗證方法都有各自的優(yōu)勢和偏差，也有一些環(huán)狀RNA驗證結(jié)果存在沖突（如下圖）。
因此，作者表明
單純的qPCR驗證是不足夠的；
qPCR+RNase R組合是OK的；
qPCR+amplicon sequencing更好。
當(dāng)然，我們可以看到大部分文章，3種驗證方法都開展了。
對于高通量環(huán)狀RNA篩選工具，多個工具得到的交集可能有更高的概率被驗證；然而，這種方式仍然無法避免假陽性結(jié)果的發(fā)生（如下圖）。另外，文章也給出了一些工具的組合供研究者參考（文章附表7-9）。
表格鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41592-023-01944-6#MOESM4
文章作者給出了中肯的建議以供環(huán)狀RNA研究者作為參考（如下表）。
同時，文章中檢測以及驗證的環(huán)狀RNA都可以在github上獲取到，地址為：
https://github.com/OncoRNALab/circRNA_benchmarking
以下是參與該研究的部分國內(nèi)大咖清單
??南京中醫(yī)藥大學(xué)，顧萬君
??武漢大學(xué)，何春江
??東南大學(xué)，溫國霞
??浙江大學(xué)，葉楚玉
??復(fù)旦大學(xué)，楊力
??上海中科院，袁國華
??北京中科院，趙方慶
??臺灣中央研究院，莊樹諄
