ACC是一種罕見(jiàn)且高度侵襲性的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其中40%表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素過(guò)量。糖皮質(zhì)激素和GR信號(hào)一直被認(rèn)為通過(guò)作用于免疫細(xì)胞抑制免疫并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。而目前GR在ACC中的作用知之甚少,因此作者通過(guò)研究GR信號(hào)活性與ACC免疫特征之間相互作用，可為免疫逃逸和免疫治療抵抗做出新的解釋?zhuān)兄陬A(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

數(shù)據(jù)來(lái)源

研究思路

作者首先對(duì)78例原發(fā)性ACC組織標(biāo)本進(jìn)行腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(CD4 T、CD8 T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的GR進(jìn)行免疫組化染色和免疫熒光分析，確定了ACC中GR表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞相關(guān)以及對(duì)預(yù)ACC患者預(yù)后的影響。隨后作者從公共數(shù)據(jù)庫(kù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)中獲得的GR靶向基因網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)了GR活性標(biāo)志(GRsig)，GRsig并構(gòu)建了相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。最后，作者根據(jù)GRsig鑒定了兩種GRsig相關(guān)亞型，并評(píng)估了兩種亞型之間免疫特征和預(yù)后分層的差異。

主要結(jié)果

1.患者特征及GR表達(dá)

作者首先對(duì)78例ACC患者的人口學(xué)數(shù)據(jù)和臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在78例ACC患者中，GR在90%的原發(fā)性ACC腫瘤中表達(dá)。每個(gè)腫瘤GR表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色和免疫反應(yīng)性評(píng)分如圖1所示。接下來(lái)作者根據(jù)GR的中位免疫反應(yīng)性評(píng)分將所有患者分為低GR組和高GR組。并檢測(cè)了GR表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)除激素分泌狀態(tài)外，與診斷年齡、性別、腫瘤分期等大部分變量均無(wú)相關(guān)性。并進(jìn)一步研究了激素分泌類(lèi)型與GR表達(dá)之間的關(guān)系，觀察到GR蛋白在產(chǎn)生皮質(zhì)醇的ACC中的表達(dá)低于非分泌皮質(zhì)醇的腫瘤(圖1D)。在非功能性腫瘤和其他激素分泌腫瘤(包括雄激素、雌激素或礦物皮質(zhì)激素)中，GR的表達(dá)沒(méi)有顯著差異(圖1D)。

圖1 GR在ACC中的表達(dá)圖譜

2.原發(fā)腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞

為了全面分析ACC中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平，作者選擇了幾種常見(jiàn)的免疫標(biāo)記，CD8α(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)、CD4 (CD4+ T細(xì)胞)、CD16(細(xì)胞毒性NK細(xì)胞)、CD11c(樹(shù)突狀細(xì)胞)和CD68(巨噬細(xì)胞)，對(duì)ACC組織切片進(jìn)行免疫熒光染色(圖2)。免疫熒光顯微鏡顯示，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是最常見(jiàn)的浸潤(rùn)細(xì)胞類(lèi)型。78例ACC標(biāo)本中88%可檢出。CD4+ T細(xì)胞在80%的ACC樣本中可見(jiàn)， NK細(xì)胞在78%的原發(fā)腫瘤中可見(jiàn)，巨噬細(xì)胞在76%的ACC樣本中可見(jiàn)。然而，只有65%的腫瘤CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞陽(yáng)性?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的研究結(jié)果表明，ACC中免疫浸潤(rùn)相對(duì)較少。

圖2 腎上腺皮質(zhì)癌浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫熒光染色

3. ACC中GR表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在GR -高、低腫瘤間的分布見(jiàn)圖3。值得注意的是，所有免疫細(xì)胞亞型的數(shù)量在GR-高ACC顯著高于GR -低ACC組。作者利用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)一步研究了原發(fā)性ACC樣品中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與GR表達(dá)的相關(guān)性(圖3F)。腫瘤GR表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤呈正相關(guān)。原發(fā)性ACC中GR和免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的熱圖也顯示，在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中，GR高的腫瘤比GR低的腫瘤更富集(圖3G)。而后作者分析了GR表達(dá)及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)ACC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)高GR表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)升高的腫瘤表現(xiàn)出最有利的生存。而腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)低，預(yù)后明顯差，表明依賴(lài)于GR表達(dá)。

圖3 GR表達(dá)與原發(fā)性ACC腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)

4. ACC中GR活性標(biāo)志的構(gòu)建

圖4描述了GRsig的識(shí)別模式和過(guò)程。首先在GEO數(shù)據(jù)集中，從非功能腫瘤和分泌皮質(zhì)醇的ACC中鑒定出1,744個(gè)差異表達(dá)基因（圖4A，B）。其次，將GEO數(shù)據(jù)集中受皮質(zhì)醇調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因與TCGA隊(duì)列中GR-高與GR-低原發(fā)性ACC的差異表達(dá)基因列表(n=1569)進(jìn)行交叉評(píng)估，獲得GR靶基因子集圖（4C，D）。接下來(lái)，在TCGA-ACC隊(duì)列中估計(jì)這些基因的mRNA表達(dá)與OS之間的預(yù)后關(guān)系，最后通過(guò)選擇34個(gè)與OS顯著相關(guān)的重疊基因構(gòu)建了一個(gè)假定的GRsig(圖4E)。GRsig中的許多基因與較差的OS相關(guān)，并且GR下調(diào)，而4個(gè)基因與較好的OS相關(guān)，并且GR上調(diào)(圖4E)。然后作者比較了TCGA隊(duì)列中GRsig表達(dá)高于中位數(shù)的ACC患者和GRsig表達(dá)低于中位數(shù)的患者的生存結(jié)果。發(fā)現(xiàn)GRsig表達(dá)高于中位數(shù)的患者與GRsig表達(dá)低于中位數(shù)的患者相比，DFS和OS較差(圖4F，G)。

圖4 腎上腺皮質(zhì)癌中GR活性特征的發(fā)現(xiàn)

5. ACC中GRsig相關(guān)亞型的鑒定

基于TCGA隊(duì)列中GRsig的表達(dá)數(shù)據(jù)，采用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)方法定義了兩個(gè)GRsig相關(guān)亞型?；诠沧R(shí)矩陣、CDF曲線等確定了TCGA隊(duì)列的最優(yōu)k值2(圖5A-C)。因此，所有ACC患者可分為兩種不同的亞型。轉(zhuǎn)錄組圖譜的熱圖進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)亞組之間基因表達(dá)模式的顯著差異(圖5D)。作者隨后進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)與第2類(lèi)患者相比，第1類(lèi)患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期顯著縮短（圖5E，F(xiàn)）。為了更好地了解兩種亞型之間潛在功能機(jī)制的差異，作者進(jìn)行了通路富集分析，發(fā)現(xiàn)簇相關(guān)差異表達(dá)基因顯著參與免疫和炎癥通路(圖5G，H)。

圖5 腎上腺皮質(zhì)癌中GRsig相關(guān)亞型的鑒定

6. GRsig相關(guān)亞型的免疫景觀

考慮到GRsig相關(guān)亞型與免疫狀態(tài)密切相關(guān)，作者基于TCGA數(shù)據(jù)集，利用xCell算法對(duì)兩種亞型的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行了探索。集群1亞型表現(xiàn)出共同淋巴樣祖細(xì)胞、B細(xì)胞漿細(xì)胞等細(xì)胞的高浸潤(rùn)，而集群2表現(xiàn)出活化的髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞、共同髓樣祖細(xì)胞等細(xì)胞的高浸潤(rùn)(圖6A)。然后作者研究了兩種亞型之間主要組織相容性復(fù)合物和T細(xì)胞刺激因子表達(dá)水平的差異?？傮w而言，大多數(shù)基因在集群2樣本中的表達(dá)傾向較高(圖6B,C)。此外，作者研究了這兩種亞型與免疫檢查點(diǎn)分子和免疫治療相關(guān)生物標(biāo)志物表達(dá)水平的關(guān)系。如圖6D、E所示，簇2大部分免疫檢查點(diǎn)分子和免疫治療相關(guān)基因均高表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)暗示GRsig相關(guān)亞型可能與免疫治療效果有關(guān)。而且為了評(píng)估GRsig的預(yù)后意義，作者構(gòu)建了基于TCGA隊(duì)列的ACC患者預(yù)后模型。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分臨界值將TCGA-ACC患者分為高危亞組和低危亞組。Kaplan-Meier生存分析顯示，高危ACC患者的OS比其他患者差。

圖6 TCGA隊(duì)列中GRsig相關(guān)亞型的免疫景觀

文章小結(jié)

該文章通過(guò)病理分析聯(lián)合生信，探討了GR信號(hào)活性與ACC免疫特征之間的相互作用，在利用生信的同時(shí)結(jié)合了實(shí)驗(yàn)來(lái)提升分析結(jié)果的說(shuō)服力，中間更是加入了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型構(gòu)建、疾病分型分析和預(yù)后模型分析等亮點(diǎn)，發(fā)上10分+實(shí)至名歸！所以感興趣的小伙伴們還在等什么，趕緊碼住這個(gè)思路，換個(gè)研究對(duì)象高分文章就在前面等你！