產(chǎn)品介紹：

BrdU?作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物（其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是胸腺嘧啶的堿基嘧啶環(huán)上與5位C 原子連接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細(xì)胞合成的DNA 中。當(dāng)細(xì)胞處于DNA 合成期（S 期）,在培養(yǎng)基中加入BrdU,其就會(huì)摻入新合成的DNA中，這種BrdU 就在胞核的DNA 中長(zhǎng)期存留；再通過(guò)HRP標(biāo)記的BrdU單克隆抗體，就可以通過(guò)TMB底物顯色檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力情況。這種方法的缺點(diǎn)是；實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，并且在加入抗體之前，要充分變性DNA，才能使BrdU單克隆抗體順利結(jié)合到摻入BrdU的DNA上，同時(shí)破環(huán)了其DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響其他染料的結(jié)合。如果變性不充分，實(shí)驗(yàn)很容易失敗。

本試劑盒所用的核酸類似物為EdU,其摻入新合成DNA的原理和過(guò)程BrdU相同；EdU的集團(tuán)上還有一個(gè)炔基團(tuán)，與下游的熒光染料上的疊氮基團(tuán)，在一價(jià)銅離子催化下，發(fā)生Click chemistry反應(yīng)，也就是大家翻譯成中文的點(diǎn)擊化學(xué)。本方法與BrdU相比的主要優(yōu)勢(shì)是操作的流程更簡(jiǎn)單，并且EdU分子只有抗體分子的1/500，不需要DNA的變性步驟；從效果上來(lái)說(shuō)，EdU比BrdU有更好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

注意事項(xiàng)：

熒光試劑很容易淬滅，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡可能選擇早期時(shí)間觀察記錄結(jié)果，同時(shí)注意避光，以減緩淬滅；

為了您的安全，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中請(qǐng)注意佩戴手套。

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其他需要自備試劑材料：

??1×PBS（pH 7.2-7.6）

? 細(xì)胞固定液（含 3.7%甲醛的 PBS）

? 細(xì)胞透膜液（含 0.5% Triton? X-100 的 PBS）

?????1×Hoechst 33342 染色液

? 含 3% BSA 的 PBS（pH 7.4）

? 去離子水

? 18×18 mm 蓋玻片

各種規(guī)格吸頭及移液細(xì)胞培養(yǎng)耗材。

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試劑盒儲(chǔ)存：

2-8°C,避光，干燥，不要凍存。。

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試劑盒操作流程圖：

細(xì)胞爬片制備（細(xì)胞鋪板培養(yǎng)）→細(xì)胞處理（可選）→EdU與細(xì)胞共培養(yǎng)→細(xì)胞固定及細(xì)胞膜透化處理→檢測(cè)EdU（click chemistry）→抗體或者其他染料染色→圖像捕獲及分析

具體使用操作方法：

1.???EdU的標(biāo)記

正式實(shí)驗(yàn)前，最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的標(biāo)記濃度,因?yàn)榧?xì)胞類型，細(xì)胞密度，細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件不同，最佳包被濃度也不盡相同。預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，建議從10uM的濃度做幾個(gè)濃度的梯度來(lái)確定最佳使用濃度。

1.1將洗凈滅菌的蓋玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)板孔，將合適濃度的細(xì)胞鋪到蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁及正常生長(zhǎng)到合適的密度；

1.2?將EdU溶液用培養(yǎng)基稀釋到20 μM EdU?初始濃度，使用的時(shí)候，加入與細(xì)胞培養(yǎng)液相同體積的以上工作液；例如實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液為200ul,吸去100ul培養(yǎng)液，然后加入100ul EdU溶液即可；

1.3細(xì)胞重新放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)度和培養(yǎng)條件是根據(jù)細(xì)胞類型確定的，確切的說(shuō)就是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和周期確定的。

以下信息僅供參考：人胚胎細(xì)胞細(xì)胞周期約30分鐘，EdU培養(yǎng)?5-10分鐘；人的神經(jīng)細(xì)胞周期是5天，EdU培養(yǎng)?24小時(shí)；人的其他細(xì)胞一般生長(zhǎng)周期20小時(shí)左右，EdU培養(yǎng)?2小時(shí)左右。

2.???細(xì)胞固定及膜透化處理

吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，將含有細(xì)胞爬片的板孔內(nèi)加入1ml細(xì)胞固定液（含3.7%甲醛的PBS）室溫固定細(xì)胞15分鐘

吸干細(xì)胞固定液，每孔用1ml洗滌液(含3% BSA的PBS)浸泡5分鐘；

吸干細(xì)胞清洗液，每孔加入1ml細(xì)胞膜透化液（含0.5%的TritonX-100）,室溫進(jìn)行膜透化處理20分鐘。

3.???EdU的檢測(cè)

3.1 ?10XEdU檢測(cè)液的配制，將試劑EdU管內(nèi)加入1ml去離子水，即為10XEdU檢測(cè)液，使用后及時(shí)存放在-20℃，可以穩(wěn)定保存1年。

3.2 ?EdU檢測(cè)工作液配制：用去離子水將10XEdU檢測(cè)液稀釋10倍，即為EdU檢測(cè)工作液（比如，需要1mlEdU檢測(cè)工作液,取10XEdU檢測(cè)液100ul,加入900ul去離子水，混勻即可），現(xiàn)配現(xiàn)用，不可儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 ?EdU檢測(cè)反應(yīng)體系配置，參照下表配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，存儲(chǔ)不超過(guò)20分鐘。

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EdU檢測(cè)反應(yīng)體系參考表(各組分體積單位：ul)

試劑組分

蓋玻片數(shù)量

5

10

Reaction Buffer

430

860

CuSO4

20

40

Flour azide

1.5

3

EdU檢測(cè)工作液

50

100

總體積

500

1000

3.4??配制EdU檢測(cè)反應(yīng)體系的同時(shí)，立即吸干細(xì)胞膜透化液，每孔加入1ml含3% BSA的PBS浸泡清洗5分鐘，重復(fù)一次；

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3.5?吸干清洗液，每孔加入100ul EdU檢測(cè)反應(yīng)液，

3.6?室溫避光反應(yīng)30分鐘

3.7吸干EdU檢測(cè)反應(yīng)液，入1ml含3% BSA的PBS浸泡清洗5分鐘，重復(fù)1-2次。

某些細(xì)胞貼壁能力較強(qiáng)，背景會(huì)偏高，可以使用甲醇清洗1-2次，再用含3% BSA的PBS浸泡清洗5分鐘，重復(fù)1-2次。

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4.???染色細(xì)胞核（如果需要）

推薦選用 1×Hoechst 33342進(jìn)行DNA染色

染色的步驟如下：

4.1?每孔加入?1 ml PBS?浸泡清洗細(xì)胞，吸干細(xì)胞清洗液。

4.2?配制1×Hoechst 33342?染色液。

4.3?每孔加入?200 μl 1×Hoechst 33342?染色液。室溫孵育?15?分鐘，注意避光。吸干?Hoechst 33342?染色液。

4.4?每孔加入?1 ml PBS?浸泡清洗細(xì)胞?5?分鐘，重復(fù)一次。吸干PBS。

5.???5.?成像及分析

將細(xì)胞爬片晾干，封片，選擇合適的波長(zhǎng)在熒光顯微鏡下觀察并記錄圖像。