?西北農(nóng)林科技大學發(fā)現(xiàn)小麥TaFDL2-1A和TabZIP8-7A介導抗旱分子機制

2021年8月，西北農(nóng)林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室李學軍教授在Plant Science雜志中發(fā)表了題為“TaFDL2-1A interacts with TabZIP8-7A protein to cope with drought stress via the abscisic acid signaling pathway”的研究論文，報道了小麥基因TaFDL2-1A 和 TabZIP8-7A介導的耐干旱分子機制。

?

文章中酵母雜交工作為上海歐易生物協(xié)助完成。

?

?研究背景?

干旱是限制谷物生產(chǎn)的主要環(huán)境因素，在1964-2007年期間，干旱造成的平均損失為10.1%。了解應對干旱脅迫的關鍵基因?qū)τ谔岣咦魑锂a(chǎn)量至關重要。最近，一些在植物對干旱脅迫的反應中起重要作用的基因被鑒定出來，包括轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、激酶、分子鏈和其他功能蛋白。其中擬南芥和水稻中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫響應中的分子機制研究的較為清楚，但是對小麥中bZIP轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫中的研究較少。

?

?研究內(nèi)容?

本研究從小麥中分離到三個編碼核蛋白的TaFDL2同源基因，干旱和ABA處理可誘導這三個基因的表達。在擬南芥中過表達TaFDL2-1A或其相互作用蛋白TabZIP8-7A可提高植株抗旱性和對ABA的敏感性。遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析表明TaFDL2-A或TabZIP8-7A通過ABA信號通路促進應激響應基因表達。此外，TaFDL2-1A和TabZIP8-7A通過形成轉(zhuǎn)錄激活復合物以更有效的方式協(xié)同激活ABA誘導的基因表達。研究結(jié)果表明TaFDL2-1A通過ABA信號途徑與TabZIP8-7A相互作用以應對干旱脅迫。

?

?研究結(jié)果?

1.?TaFDL2基因的分離鑒定

在春小麥中共找到3個TaFDL2同源基因，分別位于染色體1A、1B和1D（圖1）上，命名為TaFDL2-1A, TaFDL2-1B, and TaFDL2-1D，?分別含有328，326和327個氨基酸，三個基因具有約98%的序列同源性。

?

分析發(fā)現(xiàn)三個同源基因的啟動子區(qū)域（起始密碼子上游1.5 Kb的序列）含有許多預測的應激反應相關順式作用元件(http://bioinformatics.psb.ugent.be)（圖1），例如MYB識別位點、MYC識別位點、W box、ACE、DRE和G-box等，基于高度保守的氨基酸序列和類似的順式作用元件，可以認為三個TaFDL2同源基因可能具有平行的生物學功能。

圖1?TaFDL2的基因定位及元件分析

?

2.?TaFDL2的表達及亞細胞定位

利用qRT-PCR分析應激處理下TaFDL2的表達模式以評估啟動子區(qū)域的多個應激反應相關順式作用元件。結(jié)果表明干旱、PEG6000和外源ABA的處理均可誘導這三個基因的表達（圖2），從而說明TaFDL2-1A、TaFDL2-1B和TaFDL2-1D在某些方面尤其是在干旱脅迫中可能存在功能冗余。TaFDL2-1A、TaFDL2-1B和TaFDL2-1D三個基因在各組織中都能被檢測到，其中TaFDL2-1A的表達水平最高（圖2）。后續(xù)選擇TaFDL2-1A進行進一步實驗。對TaFDL2的亞細胞定位分析表明這三種蛋白都在細胞核中表達（圖3）。

圖2?TaFDL2的表達模式分析

?

圖3?TaFDL2的亞細胞定位

?

3.?TaFDL2-1A的轉(zhuǎn)錄活性

TaFDL2是一種bZIP TF，自激活檢測結(jié)果顯示完整的TaFDL2-1A具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且TaFDL2-1A包含兩個激活結(jié)構(gòu)域。其中結(jié)構(gòu)域D（129-151aa）對這兩個結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄活性有不同的影響（圖4）。

圖4?TaFDL2-1A的轉(zhuǎn)錄活性檢測

?

4.?TaFDL2-1A的擬南芥過表達植株耐旱性和ABA敏感性增強

TaFDL2-1A的擬南芥過表達植株在干旱處理中其抗旱性明顯優(yōu)于野生型，干旱處理后，WT的相對含水量（RWC）、葉綠素含量、氣孔孔徑和葉片失水率以及重新澆水后的存活率（圖5）顯著低于過表達株系。此外，過表達TaFDL2-1A的株系蓮座葉發(fā)育遲緩且花期提前，但是最終的株高與野生型無明顯差異。在所有情況下，TaFDL2-1A的過表達植株增加了對干旱脅迫的耐受性。此外，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植物中的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性高于野生型植物，而丙二醛（MDA）含量較低（圖5）。

?

這些結(jié)果表明，脯氨酸含量和抗氧化酶活性水平可能在TaFDL2-1A過表達植物的抗旱能力中起著重要作用。ABA敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，在ABA處理下，OE1、OE3和OE7中具有綠色子葉的幼苗的百分比顯著低于WT，但在對照條件下沒有顯著差異（圖5）。這些結(jié)果表明，TaFDL2-1A轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出ABA超敏反應。

圖5?過表達TaFDL-1A植株的各項指標

?

5.?TabZIP8-7A與TaFDL2-1A具有相互作用

選擇BD C2（152-328 aa）通過酵母雙雜交（Y2H）篩選相互作用蛋白。篩選到的三個陽性克隆含有相同的編碼序列（CDS），該基因位于7A染色體上。命名為TabZIP8-7A。將全長TabZIP8-7A融合到GAL4激活域（AD-TabZIP8-7A），然后與BD-C2共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母菌株中。結(jié)果表明，TabZIP8-7A在酵母中與TaFDL2-1A具有相互作用（圖6）。

?

Pull down和Bifc實驗結(jié)果都表明TaFDL2-1A在體內(nèi)和體外都與TabZIP8-7A相互作用。TaFDL2的三個同源基因都可在ABA和干旱處理下被誘導表達， ABA和干旱脅迫處理也上調(diào)了TabZIP8-7A的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果以及TaFDL2-1A和TabZIP8-7A之間的相互作用表明，TabZIP8-7A可能參與ABA信號和抗旱性的調(diào)節(jié)。

圖6?TabZIP8-7A與TaFDL2-1A具有相互作用

?

6.?TabZIP8-7A正向調(diào)節(jié)擬南芥抗旱性和ABA信號通路

過表達TabZIP8-7A的擬南芥植株在干旱處理后顯示出比野生型植株略萎蔫和顏色更綠的表型（圖7）。干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的RWC和葉綠素的含量明顯高于野生型植株。此外，與野生型相比，TabZIP8-7A過表達植株的脯氨酸含量和SOD活性較高，但是MDA含量、氣孔孔徑和水分損失較低，且轉(zhuǎn)基因植株的幼苗綠化率低于野生型植物（圖7）。這些結(jié)果表明，在擬南芥中過表達TabZIP8-7A可增強抗旱性和ABA敏感性。

圖7?過表達TabZIP8-7A擬南芥植株表型統(tǒng)計

?

7.?TaFDL2-1A×TabZIP8-7A雙過表達植株表現(xiàn)出最高的抗旱性

雙過表達植株在干旱處理后大多數(shù)葉片呈綠色并伸展，而野生型植株的葉片枯萎和萎蔫。在轉(zhuǎn)基因植株和重澆水后的WT中，雙過表達植物的存活率最高。此外，在干旱條件下，雙過表達植物的葉片RWC、葉綠素含量，脯氨酸含量和SOD活性也最高（圖8）。以上結(jié)果表明，TaFDL2-1A和TabZIP-7A雙過表達植株表現(xiàn)出最大的抗性。在ABA敏感性實驗中，在WT和轉(zhuǎn)基因植物種，雙過表達植物在ABA處理下的幼苗綠化率最低，從而證明雙過表達植株對ABA表現(xiàn)出最高的超敏感性。

圖8?雙過表達植株的各項生理指標統(tǒng)計

?

8.?轉(zhuǎn)基因擬南芥逆境反應基因表達的增強

使用qRT-PCR檢測應激相關基因和活性氧清除相關基因的表達水平。包括Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶1（P5CS1）的六個基因的表達水平，對ABA 18（RAB18）反應，脫水響應元件結(jié)合蛋白2A（DREB2A）、脫水響應蛋白29B（RD29B）、ABA響應元件（ABRE）結(jié)合因子3（ABF3）和銅/鋅超氧化物歧化酶1（CSD1）在干旱脅迫下均上調(diào)（圖7A-F）。此外，轉(zhuǎn)基因植物中這些基因的表達水平明顯高于野生型植物，其中TaFDL2×TabZIP8雙過表達植物的表達水平最高（圖7A-F）。這些結(jié)果與干旱條件下轉(zhuǎn)基因植物的抗逆表型一致。因此，TaFDL2-1A或TabZIP-7A可能通過調(diào)控脅迫響應基因在干旱脅迫下發(fā)揮積極作用。

?

圖9?轉(zhuǎn)基因擬南芥逆境反應基因表達增強

?

9.?TaFDL2-1A-TabZIP8-7A復合物具有最高的反式激活活性

研究表明TaFDL2-1A和TabZIP8-7A能與ACGT核心序列結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄。GUS活性測定結(jié)果顯示TaFDL2-1A、TabZIP8-7A和TaFDL2-1A-TabZIP8-7A轉(zhuǎn)錄激活復合物通過直接結(jié)合G-box激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，其中TaFDL2-1A-TabZIP8-7A復合物具有最高的轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，TaFDL2-1A和TabZIP8-7A均可直接與EMSA中的TaLEA 7-24啟動子結(jié)合（圖10）。因此，TaFDL2-1A、TabZIP8-7A和TaFDL2-1A-TabZIP8-7A復合物介導ABA誘導基因轉(zhuǎn)錄，并且轉(zhuǎn)錄水平與干旱條件下轉(zhuǎn)基因植物中脅迫響應基因的表達水平一致。

圖10 TaFDL2-1A-TabZIP8-7A復合物具有最高的反式激活活性

?

?研究總結(jié)?

本文通過ABA信號通路探討了TaFDL2-1A在干旱脅迫響應中的作用的分子機制。干旱條件和外源ABA誘導TaFDL2在細胞核中表達，全長TaFDL2-1A具有轉(zhuǎn)錄激活活性，并且結(jié)構(gòu)域D對N端和C端的反式激活活性有不同的影響。TaFDL2-1A的過度表達誘導了植株對干旱脅迫的抗性和對ABA的敏感性，并可能通過調(diào)控ABA誘導基因在干旱脅迫中發(fā)揮積極作用。TabZIP8-7A被鑒定為一種與TaFDL2-1A相互作用的蛋白質(zhì)，是干旱脅迫和ABA信號通路中的正向調(diào)節(jié)因子。

?

此外，由TaFDL2-1A與TabZIP8-7A相互作用形成的異源二聚體復合物可以增強TaFDL2-1A或TabZIP8-7A單獨的反式激活活性，并且發(fā)現(xiàn)共表達TaFDL2-1A和TabZIP8-7A獲得最高的相對GUS活性和相對熒光素酶活性。該復合物導致ABA誘導基因的最高表達水平，因此TaFDL2-1A×TabZIP8-7A雙過表達植物具有最高的耐旱能力。因此，TaFDL2-1A可以通過ABA信號途徑與TabZIP8-7A蛋白相互作用，協(xié)同促進干旱脅迫耐受。

?

?參考文獻?

Bx Wang, Lq Li,?et,al?TaFDL2-1A interacts with TabZIP8-7A protein to cope with drought stress via the abscisic acid signaling pathway,?Plant Science, 311(2021)111022.
?