隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,全球化資源整合為生物制藥行業(yè)提供了越來越全面的技術(shù)支撐,抗體藥物的發(fā)展也獲得越來越多的重視?？贵w藥物開發(fā)是一個(gè)非常繁雜的過程,而穩(wěn)定細(xì)胞株適用于抗體藥開發(fā)的各個(gè)階段,如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、檢測分析、功能性研究等等。構(gòu)建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達(dá)細(xì)胞株是第一步也是關(guān)鍵步驟之一。

普健生物在重組蛋白表達(dá)、抗體生產(chǎn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建等方面有著10余年經(jīng)驗(yàn)。今天小普與大家分享一種基于CHO細(xì)胞株構(gòu)建的高效抗體藥開發(fā)策略,能顯著提高細(xì)胞株開發(fā)效率,實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的細(xì)胞株開發(fā)。

CHO表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用于生產(chǎn)單抗在內(nèi)的商業(yè)化治療性蛋白產(chǎn)品的主要宿主細(xì)胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的首選宿主細(xì)胞,因?yàn)榕c其他系統(tǒng)相比,CHO細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①CHO 細(xì)胞對(duì)蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能,因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；

②CHO 細(xì)胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對(duì)較強(qiáng),可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式；

③整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定,重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá)；

④表達(dá)目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外,并且CHO 細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白,有利于目的蛋白的提取。

GS篩選系統(tǒng)原理

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)生長過程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)將谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過這一酶促反應(yīng)獲得谷氨酰胺。

CHO細(xì)胞內(nèi)源的谷氨酰胺合成酶活性比較低,需要在培養(yǎng)基中額外添加外源谷氨酰胺才能促進(jìn)細(xì)胞生長。利用GS抑制劑,L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制內(nèi)源性GS活性，用含目的基因和GS基因標(biāo)記的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染宿主CHO細(xì)胞,通過MSX加壓篩選，促使GS基因和目的蛋白基因擴(kuò)增,只有轉(zhuǎn)染了額外GS基因的細(xì)胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培養(yǎng)基中生長,從而篩選獲得重組表達(dá)細(xì)胞株。

篩選策略

01 宿主細(xì)胞選擇

工業(yè)上主要使用兩大類CHO細(xì)胞：

①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza);

②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。

02 細(xì)胞株篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源分子(如DNA,RNA)導(dǎo)入真核細(xì)胞，細(xì)胞株篩選方案包括一系列步驟：

01
重組載體構(gòu)建

選擇適合的信號(hào)肽，對(duì)抗體重輕鏈基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將目的基因構(gòu)建到普健專有的GS載體上。

轉(zhuǎn)染及Minipools篩選
02

使用普健生物專利的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后,加壓篩選Minipools。利用ELISA或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個(gè)minipools,逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至TPP搖管中,利用簡單的流加表達(dá)工藝篩選出3個(gè)最優(yōu)的minipools。

03
細(xì)胞株單克隆化

采用特定的有限稀釋方法鋪板,Imager跟蹤成像。利用ELISA或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個(gè)單克隆,逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至TPP搖管中，利用簡單的流加表達(dá)工藝篩選出10株最優(yōu)的單克隆。將10株最優(yōu)的單克隆傳至搖瓶中,利用特定的搖瓶工藝對(duì)10株單克隆進(jìn)行細(xì)胞生長特性,代謝特性,產(chǎn)量,抗體糖基化修飾,抗體聚體等質(zhì)量分析，綜合篩選出最優(yōu)的3株生產(chǎn)用細(xì)胞株。

個(gè)性化產(chǎn)量優(yōu)化和糖型調(diào)節(jié)
04

普健生物有多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基及流加表達(dá)培養(yǎng)方案?？梢愿鶕?jù)不同的細(xì)胞株生長特性,篩選出最優(yōu)的流加表達(dá)工藝。同時(shí),也可以用特定的調(diào)糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)不同的糖型的比例。

05
完善的抗體質(zhì)量評(píng)估系統(tǒng)

主要包括:抗體效價(jià)、活性分析,抗體聚體分析,抗體糖基化分析,抗體效能分析等。

生產(chǎn)細(xì)胞株穩(wěn)定性分析
06

包括基因型穩(wěn)定性分析及30個(gè)代次的傳代穩(wěn)定性分析。

案例展示

構(gòu)建生產(chǎn)重組抗體的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株。

Fig.1 單克隆產(chǎn)量分析

Fig.2 流加表達(dá)測試產(chǎn)量優(yōu)化

Fig.3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）

Fig.4 抗體親和力分析（Biacore）

Fig.5?細(xì)胞株穩(wěn)定性分析圖

XtenCHOTM高密度表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑、表達(dá)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基相較于常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、商業(yè)化CHO培養(yǎng)基以及補(bǔ)料培養(yǎng)基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規(guī)模較大的重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)生產(chǎn)中更能體現(xiàn)其性價(jià)比高的特點(diǎn)。

普健生物穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

普健生物擁有高效的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建體系，從上游的雜交瘤抗體測序，到序列優(yōu)化，人源化，再到細(xì)胞株構(gòu)建，個(gè)性化細(xì)胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測，整個(gè)技術(shù)體系成熟，儀器配備齊全，能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。普健生物憑借十余年的抗體藥物研發(fā)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，自主開發(fā)了CHO-GS KO細(xì)胞系及GS載體系統(tǒng)，抗體表達(dá)產(chǎn)量>3g/L以上。自主研發(fā)了CHO細(xì)胞專利轉(zhuǎn)染技術(shù)，及提高抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定細(xì)胞株篩選技術(shù)。擁有完善的抗體質(zhì)量分析平臺(tái)，可以提供ELISA、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。

詳情可點(diǎn)擊下圖或文字鏈接。

服務(wù)流程

服務(wù)優(yōu)勢

高質(zhì)：外源基因嚴(yán)格鑒定，細(xì)胞來源清晰，無污染。

高產(chǎn)：重組蛋白/抗體表達(dá)量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達(dá)。

經(jīng)驗(yàn)豐富：專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，已成功為國內(nèi)外多家醫(yī)藥公司和研究單位構(gòu)建交付穩(wěn)定細(xì)胞株。

多篩選系統(tǒng)：G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng)，GS/DHFR 篩選系統(tǒng)等。

文末福利活動(dòng)來啦~

利用高效穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

加速抗體藥物研發(fā)進(jìn)程

So,普健生物CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)您種草了嗎？

看到這里，小普必須為大家送上福利

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活動(dòng)截止2月12日中午12:00