生物制品是指利用生物體（如微生物、寄生蟲等）、生物組織或動物毒素等成分，綜合運用生物學、生物化學等學科的原理與方法制得的具有疾病治療效用的生物活性制劑。生物制品可能由糖、蛋白質(zhì)或核酸組成，或者這些物質(zhì)的復雜組合，也可能是如細胞和組織這樣的活體實體，主要包括疫苗、血液及血液成分、抗原、單克隆抗體以及重組治療性蛋白等制品。分子量是蛋白質(zhì)主要特征參數(shù)之一，是確定一種蛋白、進行蛋白質(zhì)后續(xù)研究活動的重要前提。因此準確有效地對蛋白質(zhì)分子量進行測定十分重要。

百泰派克生物科技BTP提供基于凝膠電泳法、MALDI-TOF測分子量、LC-MS測分子量、SEC分子量分布等方法的分子量分析服務。

一、凝膠電泳法分子量分析

1. 原理:

SDS-PAGE凝膠電泳是一種基于電泳分離的技術(shù)，在這種技術(shù)中，SDS（十二烷基硫酸鈉）被用作蛋白質(zhì)分子的表面活性劑，以便將蛋白質(zhì)分子的電荷中和，從而使它們按照大小分離。

2. 實驗儀器:

電泳儀

3. 應用:

可以根據(jù)標準品的分子量與遷移率做標曲，對目的蛋白的分子量進行計算（10-200kDa），還可以根據(jù)條帶的深淺用軟件進行純度的計算。優(yōu)勢是耗時短、成本低。

4. 案例示意：

二、 MALDI TOF法分子量分析

1. 原理:

MALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜）一種軟電離生物質(zhì)譜,電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子,而使生物分子電離,離子在電場作用下加速飛過飛行管道,根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，由于得到離子帶單電荷，不需要通過計算即可得到分子量結(jié)果。

2. 實驗儀器:

microflex? MALDI-TOF（Bruker）

3. 應用:

適用于混合物及生物大分子的測定，有快速、準確、靈敏度高、質(zhì)量范圍寬等優(yōu)勢；不適用于高分辨質(zhì)譜的含復雜糖基化、PEG修飾等樣品可以用MALDI-TOF檢測。

4. 案例示意:

圖中橫坐標為分子量，縱坐標為信號強度

三、 LC-MS分子量分析

1. 原理:

樣品溶液在電場的作用下形成帶高度電荷的霧狀小液滴，在向質(zhì)量分析器移動的過程中，經(jīng)過電離，最后得到帶單電荷或多電荷的離子。得到的不同電荷離子經(jīng)過去卷積計算得到最終的蛋白質(zhì)分子量。

左圖為樣品進質(zhì)譜過程，右圖為帶不同電荷的質(zhì)譜圖

2. 實驗儀器:

? 高效液相色譜儀：Ultimate 3000（Thermo Fisher Scientific）

? 電噴霧-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀：AB SCIEX TripleTOF 5600（AB SCIEX）

3. 應用:

高分辨率質(zhì)譜可以對蛋白質(zhì)樣品進行精確分子量測定（10-250 kDa），精度達到1Da，可分析蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)（比如磷酸化、小分子藥物結(jié)合等），并對這些修飾情況進行相對定量分析；還可以對抗體的原始、還原、切糖分子量進行檢測，以及抗體藥物偶聯(lián)的檢測。優(yōu)勢是高靈敏度、高分辨率、高準確度。

4. 案例示意:

如圖為去卷積后的分子量，橫坐標為分子量，縱坐標為信號強度

四、 SEC分子量分布法

1. 原理：

SEC的分離機理是不同分子量大小的蛋白在通過多孔載體時所用時間不同，樣品按分子尺寸由大到小的順序依次流出。通過標準品的出峰時間和信號強度即可計算樣品的分子量分布。

2. 實驗儀器：

高效液相色譜（紫外檢測器）：Waters 2695/2996

3. 應用：

可以對混合樣品的分子量進行檢測，適用于較為復雜的混合樣品。

4. 案例示意：

如圖橫坐標為出峰時間，縱坐標為紫外信號值，表格為分子量分布

這四種方法有各自的優(yōu)勢和局限，比如想要快速得到樣品的大致分子量和純度，可以采用凝膠電泳法，想要得到較為準確的分子量，且樣品量較低，可以使用LC-MS進行檢測，如果目的蛋白含有較多的糖基化或PEG修飾，或者分子量在150kDa以上，可以使用MALDI-TOF進行檢測，如果是較為復雜的混合樣品，需要得到樣品的大致分子量情況，可以用SEC分子量分布的方法進行檢測。

常見問題"

問題1：高分辨質(zhì)譜測定分子量的優(yōu)勢和局限分別是什么？

回答：優(yōu)勢：具有高靈敏度、分辨率和準確度，需要的樣品量較少，可以檢測蛋白質(zhì)的精確分子量，可以分析較為復雜的混合樣。局限：對于含大量糖基化和較多修飾的樣品檢測效果較差。

問題2：為什么用高分辨質(zhì)譜只檢測到單體分子量，沒檢測到非共價多聚體分子量？

回答：常規(guī)檢測方法樣品前處理過程和洗脫過程中會將非共價多聚體打成單體，檢測非共價多聚體分子量需要使用native ms的方法進行檢測。