IF=37.3 | miRNA治療骨肉瘤最新機制
骨肉瘤（OS）是最常見的骨科惡性腫瘤，OS患者的常見治療選擇為手術切除、放療和化療。然而，化療后耐藥和術后遠處轉(zhuǎn)移仍然是導致預后不良、治療失敗的關鍵因素。目前仍需通過闡明OS的發(fā)展機制，尋找一種新的早期診斷特征來探索OS的治療策略。外泌體是微小的細胞間囊泡，其通過攜帶各類調(diào)控分子既促進腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移，也在抑制腫瘤進展方面也發(fā)揮了重要作用。近日，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院薄占東團隊在Molecular Cancer（IF=37.3）上發(fā)表文章“Exosome-mediated miR-144-3p promotes ferroptosis to inhibit osteosarcoma proliferation, migration, and invasion through regulating ZEB1”，對外泌體中的miRNA-144-3p與OS病例特征的相關性和調(diào)控鐵死亡的機制進行了具體闡述。
在該研究中，作者使用了漢恒生物提供的慢病毒和腺病毒進行miR-144-3p和ZEB1的敲低和過表達，并使用漢恒生物提供的雙熒光素酶檢測試劑盒進行miR-144-3p與ZAB1結合驗證。
首先，作者通過分析GEO中與OS相關的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)miR-144-3p在OS患者中表達下調(diào)，miR-144-3p低表達患者具有更短的生存時間，通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)OS細胞株和成骨細胞及OS患者癌旁組織中miR-144-3p普遍下調(diào)，表明miR-144-3p是OS有價值的預后生物標志物。作者應用miRDB數(shù)據(jù)庫根據(jù)靶標評分排名預測下游基因ZEB1 mRNA可能為靶mRNA，進一步的雙熒光素酶檢測結果表明二者間存在結合作用。OS細胞株、成骨細胞和OS患者癌旁組織的qPCR和IHC結果表明ZEB1表達顯著上升，其高表達與OS患者預后較差相關。
圖1. miR-144-3p為OS關鍵 miRNA
隨后，作者從h143B細胞中分離了外泌體并檢測，發(fā)現(xiàn)外泌體特征蛋白在外泌體裂解液中高表達，將紅光標記的外泌體與OS細胞共培養(yǎng)，可以在胞內(nèi)觀察到明顯的紅色熒光染色，這證實了外泌體可以作為載體將生物分子運輸?shù)郊毎?。作者進行了OS組織外泌體微陣列，結果顯示人OS組織外泌體中miR-144-3p的表達同樣呈現(xiàn)顯著降低。為驗證miR-144-3p對ZEB1的調(diào)控作用，作者在h143B細胞中敲低或過表達miR-144-3p或ZEB1，發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達與miR-144-3p呈負相關。
圖2. h143B細胞miR-144-3p/ZEB1軸
接下來，作者驗證了MiR-144-3p對OS細胞表型的影響，CCK8和跨孔測定結果顯示miR-144-3p的過表達顯著降低OS細胞活力、侵襲和遷移能力。裸鼠成瘤實驗中，miR-144-3p過表達組的OS體積在核磁共振影響和直接測量結果中均小于NC組。
圖3. MiR-144-3p 抑制操作系統(tǒng)增殖、侵襲和遷移
為了研究miR-144-3p是否通過鐵死亡機制抑制OS生長，作者應用TEM、GSH等方式檢測相關指標的改變。miR-144-3p過表達組表現(xiàn)為更顯著的線粒體鐵死亡畸變形態(tài)、較低的GSH / GSSG比率、升高的Fe2+水平、MDA水平和ROS水平。OS細胞和CDTX模型組織的WB、RT-qPCR和IHC結果顯示miR-144-3p的表達與促鐵死亡分子ACSL4呈正相關、與抗鐵死亡分子xCT和GPX4負相關。
圖4. MiR-144-3p正向調(diào)控細胞內(nèi)鐵死亡
隨后，作者探究了ZEB1對體內(nèi)和體外OS發(fā)展的影響。ZEB1過表達后OS細胞的活力、遷移和侵襲顯著上升，腫瘤體積顯著增加。ZEB1與線粒體鐵死亡特異性形態(tài)改變、Fe2+水平、MDA和ROS，與GSH/GSSG比值正相關。OS細胞和CDTX模型組織的WB、RT-qPCR和IHC結果顯示ZEB1的過表達導致ACSL4的表達水平降低，xCT和GPX4的表達水平升高。這表明ZEB1可以積極調(diào)節(jié)OS進展，且通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝抑制鐵死亡，F(xiàn)e2+穩(wěn)態(tài)，MDA水平和ROS水平。
圖5. ZEB1正向調(diào)節(jié)OS發(fā)展，其表達與鐵死亡水平呈負相關
最后，作者設計了一個基于轉(zhuǎn)染分組的功能挽救實驗來驗證miR-144-3p/ZEB1軸的功能和鐵死亡機制。CCK-8測定和跨孔測定的結果表明ZEB1的過表達可以挽救miR-144-3p的腫瘤抑制作用，體內(nèi)實驗表明，miR-144-3p表達的增加可以通過調(diào)節(jié)ZEB1抑制OS生長。ZEB1可以恢復miR-144-3p對鐵死亡相關途徑的作用，包括線粒體形態(tài)， GSH/GSSG比值，F(xiàn)e2+，MDA和ROS水平。ZEB1在體外實驗和體內(nèi)實驗中挽救了由miR-144-3p改變的鐵死亡相關分子表達。以上結果表明ZEB1可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡來挽救miR-144-3p對OS的影響。
圖6. ZEB1挽救miR-144-3p引起的增殖、侵襲和遷移改變
圖7. ZEB1恢復miR-144-3p引起鐵死亡變化
作者通過臨床組織、體外細胞實驗和體內(nèi)CDTX模型等一系列實驗證明了外泌體中的miR-144-3p和ZEB1可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡機制來調(diào)控OS的發(fā)育，這證實鐵死亡相關的miRNA作為OS的抗癌治療靶點或診斷生物標志物具有巨大潛力，但依然存在如樣本規(guī)模相對較小等局限，這限制了研究的準確性。綜上所述，該研究已證明miR-144-3p/ZEB1軸的治療潛力，并為進一步揭示和闡述miRNA、鐵死亡與OS之間的關系，探究抗癌治療靶點或診斷性生物標志物打下基礎
