NHS-Biotin是最常用的胺反應性生物素衍生物，用于修飾蛋白質(zhì)和其他生物分子。 這種伯胺偶聯(lián)劑已成功用于體內(nèi)選擇性標記大腸桿菌細胞包膜蛋白。 它優(yōu)先標記外膜、周質(zhì)和內(nèi)膜蛋白以及特定的內(nèi)膜標記蛋白 (Tet-LacZ)。

圖1.NHS-Biotin化學結(jié)構(gòu)

反應原理

已知生物素與抗生物素蛋白牢固結(jié)合，其特性已廣泛用于高靈敏度分析。由于生物素與抗生物素蛋白之間的結(jié)合穩(wěn)定性常數(shù)為1015，比抗原-抗體反應高3至4個數(shù)量級，因此一旦結(jié)合至抗生物素蛋白的生物素在生理條件下不會脫落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化學修飾，并且可以在不損害蛋白質(zhì)等的活性的情況下進行標記。因此，已經(jīng)開發(fā)出許多生物素化合物作為使用抗體進行免疫測定的標記劑。具有活性酯基的生物素通常用于與蛋白質(zhì)的氨基（NH2）結(jié)合，具有馬來酰亞胺基的生物素用于巰基（SH）。

圖2.NHS-Biotin與蛋白質(zhì)氨基結(jié)合

蛋白質(zhì)的生物素標記操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白質(zhì)，制成蛋白質(zhì)溶液。

2) 在蛋白質(zhì)溶液中加入配制好的生物素標記試劑溶液，蛋白質(zhì)：生物素標記試劑的混合摩爾比為1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒溫搖床 (25 ℃) 中培養(yǎng)2-4 h。

標記蛋白質(zhì)的凝膠過濾及純化

1) 打開層析柱上的蓋子，棄去填充液。

2) 打開層析柱出口的蓋子，用PBS分數(shù)次洗脫，每根層析柱收集大約10ml的洗脫液，使凝膠平衡。

3) 用移液器吸取500μl標記好的蛋白質(zhì)溶液加入到層析柱中，棄去此時的流出液。

4) 在層析柱的出口處放置一個2ml的樣品管，在層析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素標記蛋白質(zhì)。

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