翻看近幾年的國自然熱點不難發(fā)現(xiàn)，線粒體及自噬可是在前三名中霸占了兩個席位的頂流了，可見線粒體+自噬的王炸組合依然是近幾年國自然的大熱門！

今天就跟大家一起來了解一下細胞自噬的經(jīng)典機制和檢測方法。

大約 60 年前，Christian de Duve 首次使用了 "自噬" 一詞，他觀察到了大鼠肝臟溶酶體中的線粒體和其他細胞內(nèi)結構的退化。多年過去，“自噬” 依舊是國自然放在心尖尖上的寶貝。作為科研 “寵兒” 的線粒體自噬，不了解可就虧大了！

一、線粒體自噬：細胞器的選擇性自噬

線粒體，作為一種雙層膜半自主細胞器，它是細胞中制造能量的結構，是細胞有氧呼吸和利用氧化磷酸化產(chǎn)生 ATP 的場所的主要場所。其 “大佬” 地位毋庸置疑，但它的功能狀態(tài)與線粒體膜電位、線粒體膜通道、線粒體 Ca2+ 濃度、呼吸鏈復合體活性、活性氧生成以及 DNA 突變密切相關。線粒體質(zhì)量控制通過蛋白質(zhì)平衡、線粒體自噬、動力學和生物發(fā)生等方式的協(xié)調(diào)來維持線粒體的完整性和功能。

1）什么時候發(fā)生線粒體自噬？

線粒體自噬 (Mitochondrial autophagy, mitophagy) 作為一種重要線粒體質(zhì)量控制機制，在活性氧 (ROS) 脅迫等應激作用下，會導致線粒體 DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA) 突變逐漸累積，還會使細胞內(nèi)線粒體膜電位降低和去極化損傷，并最終導致細胞死亡。嚴峻的生存形勢下，線粒體只好 “大開殺戒”，為了維持線粒體和細胞穩(wěn)態(tài)，防止受損線粒體損傷細胞，細胞通過選擇性地包裹和降解細胞內(nèi)受損或功能障礙的線粒體--即線粒體自噬。

既然被吃已然是定局，那么受損線粒體是如何被 “干掉” 的？這一過程與巨自噬有著很大的相似性，但它更像是細胞器的選擇性自噬去除。

線粒體自噬主要有以下 4 個關鍵步驟：

①受損線粒體去極化，失去膜電位。
②線粒體被自噬體包裹形成線粒體自噬體。
③線粒體自噬體與溶酶體融合。
④線粒體內(nèi)容物被溶酶體降解。溶酶體或液泡酸性水解酶流入自噬體降解受損線粒體。

二、線粒體自噬途徑的相關機制

線粒體自噬的機制通常分為2類：泛素依賴途徑和非泛素依賴途徑。

1）泛素依賴性途徑

花開兩朵，各表一枝。首先，我們來看一看泛素依賴性途徑，顧名思義，依賴于線粒體表面蛋白的廣泛泛素化來促進線粒體自噬。目前研究最廣泛的便是 PINK1/Parkin 通路。在這一機制中，PTEN 誘導的激酶 1 (PTEN induced kinase 1, PINK1) 堪稱線粒體自噬的得力助手。當線粒體膜電位 (Mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm) 受損時，PINK1 進入線粒體內(nèi)膜的途徑受阻，導致 PINK1 在線粒體外膜的胞質(zhì)面上穩(wěn)定聚集。同時，這會募集并激活 Parkin，Parkin 蛋白酶的空間構象發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為活化的 E3 泛素連接酶，然后泛素化線粒體上的蛋白質(zhì)。

PINK1 與 Parkin 相互作用，共同調(diào)控線粒體自噬過程以維持線粒體質(zhì)量 (圖2)。

此外，除了 PINK1-Parkin 通路之外，還有非 Parkin 依賴性的泛素依賴性通路。也就是說，PINK1 還可以通過泛素磷酸化直接招募自噬受體蛋白 (如 NIX、BNIP3 和 FUNDC1) 到線粒體，受體蛋白募集 LC3，這使得自噬體能夠吞噬線粒體。

2）非泛素依賴性途徑

盡管據(jù)了解 PINK1 和 Parkin 的激活可以觸發(fā)線粒體自噬，但線粒體自噬也可能通過其他機制進行：相比之下，非泛素依賴途徑就略顯 “清閑”，線粒體外膜 (OMM) 上有許多包含 LC3 相互作用區(qū) (LIR) 區(qū)域的蛋白，它們是自噬的受體。它們可以不經(jīng)泛素化直接與 LC3 結合，從而啟動線粒體自噬(圖 2)。

在哺乳動物中，這些受體主要包括 ?Nip3 樣蛋白 X (Nip3-like protein X, NIX) 受體、bcl2 相互作用蛋白 3 ? (BCL2-interacting protein 3, BNIP3) 受體、FUN14 結構域包含 1 (FUN14 domain ? containing 1, FUNDC1) 受體

3）線粒體自噬的相關疾病

正常的線粒體活動對細胞功能至關重要，及時的消除受損線粒體是細胞的自我保護機制。當線粒體自噬發(fā)生障礙可觸發(fā)多種疾病，如：線粒體功能障礙是阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥，亨廷頓氏癥等神經(jīng)退行性疾病的關鍵共同因素，PINK1 和 Parkin 的功能缺失突變與家族性帕金森病相關。心肌細胞的活動高度依賴于線粒體的能量供應，線粒體吞噬功能障礙可引起心肌肥厚、心律失常、心源性猝死等心血管疾病。

三、線粒體自噬，該如何檢測？

線粒體自噬是一個復雜的、動態(tài)的過程，檢測方法也在不斷的更新，小 M 以文獻為例，盤點常見的線粒體自噬研究方法！

Myoferlin 是一種在多種癌癥中過度表達的癌蛋白，已有報道表明 Myoferlin 通過與線粒體動態(tài)機制的相互作用對胰腺癌的線粒體適應性有顯著貢獻。

為證明 Myoferlin 在 PDAC 細胞系中對線粒體自噬的影響，研究者使用了 WJ460 處理 PDAC 細胞并進行線粒體形態(tài)觀察，如圖所示 WJ460 處理導致線粒體嵴結構紊亂，甚至出現(xiàn)空白區(qū)域 (圖 4a)。研究者還進行了對自噬體和線粒體進行了免疫定位：WJ460 處理的癌細胞中自噬體的數(shù)量增加，并且在 BxPC-3、Panc-1 和 PaTu 8988T 細胞系中發(fā)現(xiàn)了共定位點

(圖 4b)。此外，PDAC 在 ?WJ460 處理后，線粒體 ROS 豐度顯著降低 (圖 4c)。以上表明，在 PDAC 細胞系中，Myoferlin 的靶向抑制引起線粒體能量應激，并引發(fā)線粒體自噬。

a. 電鏡下觀察線粒體狀態(tài)。b. 免疫熒光共定位。c. 活性氧檢測

除上述線粒體形態(tài)觀察 (透射電鏡下線粒體受損情況)，ROS 濃度測定線粒體內(nèi)活性氧的積累，自噬體與線粒體免疫熒光共定位等方法，線粒體自噬的相關追蹤探針以及線粒體自噬標志物的 Western 檢測以及也是常用的檢測線粒體吞噬的方法。

舉例：在今年發(fā)表的A ?mitochondrial SCF-FBXL4 ubiquitin E3 ligase complex degrades BNIP3 and ?NIX to restrain mitophagy and prevent mitochondrial disease 一文報道了關于線粒體自噬調(diào)控和線粒體疾病的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在線粒體疾病 MTDPS13 中突變的蛋白 FBXL4 定位在線粒體外膜并發(fā)現(xiàn) FBXL4 負調(diào)控線粒體自噬，抑制線粒體自噬的過度激活。作者團隊使用 mtKeima 報告基因分析了線粒體吞噬， mtKeima 是一種針對線粒體基質(zhì)的 ph 敏感蛋白熒光蛋白，Keima 的激發(fā)光譜會隨 pH 值而變化（圖 5a)。

短波長在中性環(huán)境中的激發(fā)，而長波長會酸性環(huán)境激發(fā)，可用于區(qū)分游離線粒體和線粒體溶酶體。

a. 探針追蹤機制的示意圖。b. 免疫熒光共定位

當線粒體被溶酶體吞噬時，Keima 會處在酸性環(huán)境，如圖在 Merged 圖中，黃綠色的 mtKeima 信號標記細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體，紅色的 mtKeima 信號標記溶酶體內(nèi)的線粒體自噬。FBXL4-KO 導致線粒體數(shù)量過少，激活了線粒體自噬。自噬過程中，參與線粒體自噬的蛋白 (PINK1、Parkin、BNIP3、Nix、FUNDC1) 水平在線粒體吞噬被激活后會增加。如圖 7 所示， Fbxl4-/-小鼠的組織樣本檢測出標記物蛋白 BNIP3 和 NIX 的積累、過度線粒體自噬和線粒體數(shù)量減少。

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