“ 話不多說，直接開始今天的主題——給大家梳理一下如何通過測序得到的序列獲得最后呈現(xiàn)給讀者的系統(tǒng)發(fā)育樹！”

1、序列準備：

通過測序獲得需要鑒定的目標菌株的序列信息，一般細菌測16S rDNA（全長大約1.5 kb左右），真菌測ITS序列（500-750 bp）。

2、將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫與已知菌種序列進行比較：

以細菌的16S rDNA序列為例（需要FASTA格式）：

1）打開NCBI官網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），點擊右側(cè)的BLAST，選擇Nucleotide BLAST，進入比對頁面：（16S rDNA序列比較也可以通過EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)數(shù)據(jù)庫進行比對）

2）在blastn選項下面粘貼入比對的序列（粘貼的序列中間不能有空格），其他選項見下圖：

3）點擊BLAST進行序列比對（需要一定時間，頁面隔幾秒刷新一次）；

3、根據(jù)比對結(jié)果篩選并下載10-12條比對序列：

1）結(jié)果頁面包含了圖中所示的要素，我們可以根據(jù)相似度及評分、序列長短篩選我們想要的序列：

2）篩選規(guī)則：與我們提交序列相似度最高的一條或多條16S序列即是我們所提交序列的匹配結(jié)果（菌種鑒定時，16S序列比對結(jié)果在屬水平上具有說服力，所以會顯示有多個同屬但是不同種的結(jié)果，這說明我們的菌種屬于該屬，至于是什么種還需要通過功能基因進行進一步鑒定）。由于我們提交的序列全長為1500 bp左右，所以篩選過程中盡量選擇與之長短相差不大的模式菌株序列，實在找不到與之長度相當?shù)?，盡可能選擇全基因組序列，數(shù)量在10-13條左右（一條相似度大于98.6%的以及其他相似度小于98.6%的），且相似度最好不要集中在很小的一個范圍內(nèi)（太集中作圖效果會大大折扣）。

3）選中序列后下載FASTA格式的txt文檔就行。

4、利用MEGA軟件進行多序列比對：（大家自行去官網(wǎng)或其他途徑下載即可，任何版本都可以）

1）數(shù)據(jù)整理：將我們自己的序列和下載的序列整理到一起，然后在下載一條與比對結(jié)果顯示的屬屬于同一科的遠緣屬加入到其中作為外群；

2）打開MEGA軟件，點擊Align，選擇Create a new alignment，點擊OK，然后根據(jù)需要選擇核酸（DNA）或者氨基酸（Protein），然后在彈出的的窗口中直接復制粘貼準備好的序列，也可以選擇lnsert Sequence From File，選擇序列文件（可多選）。序列文件加載之后呈藍色背景（選中狀態(tài)），點擊W選擇Align DNA(核酸序列)或者Align protein(氨基酸序列)，在彈出的窗口中設(shè)置參數(shù)（一般默認即可，無需修改），點擊OK，開始序列比對。

3）比對完成后，需要截齊兩端含有*的序列，選中無*的或者上面是---序列，按Delete刪除即可，截齊之后保存文件為：filename.mas。

5、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：

多序列比對窗口點擊Data，選擇Phylogenetic Analysis，彈出窗口詢問：所有序列是否編譯蛋白質(zhì)，根據(jù)實際情況選擇Yes或No。

此時，返回MEGA主界面進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。MEGA主界面點擊Phylogeny，選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree，彈出的對話框詢問：是否使用當前激活的數(shù)據(jù)，選擇Yes。這時彈出建樹參數(shù)設(shè)置對話框，根據(jù)實際需要設(shè)置即可（參數(shù)見下圖），然后點擊Compute，完成建樹彈出建好的系統(tǒng)發(fā)育樹。

6、發(fā)育樹美化：

得到系統(tǒng)發(fā)育樹后，我們可以將其復制粘貼至word或者PPT進行美化，可以得到如下效果圖：

當然，您也可以通過軟件FigTree進行美化，或者在線網(wǎng)站ITOL、EvolView進行發(fā)育樹的美化。

以上就是今天所有的內(nèi)容，希望對您有所幫助?。?！

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