傳統(tǒng)的基因編輯工具主要包括一代ZFN、二代TALEN和三代CRISPR技術(shù)，ZFN與TALEN技術(shù)都是使用包含DNA識(shí)別結(jié)合域和DNA切割域的核酸酶，但存在靶標(biāo)識(shí)別率低、成本高、脫靶概率高和結(jié)構(gòu)復(fù)雜等問(wèn)題，因此，推動(dòng)了三代CRISPR技術(shù)的發(fā)展。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為基因編輯的有力工具，用于準(zhǔn)確、高效地編輯生物體的基因組。在基因研究、基因治療和基因育種等方面展示出了巨大的應(yīng)用前景。運(yùn)用CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因編輯，需要將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的兩個(gè)核心元素sgRNA和Cas9蛋白遞送到細(xì)胞內(nèi)，目前主要有三種遞送形式：

(1) 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)：采用分別表達(dá)sgRNA和Cas9的DNA質(zhì)粒(或sgRNA和cas9共表達(dá)質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)gRNA和Cas9蛋白，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的編輯。

(2) RNA瞬轉(zhuǎn)：體外合成sgRNA和表達(dá)Cas9蛋白的mRNA，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將兩者遞送至細(xì)胞內(nèi)，Cas9的mRNA可由細(xì)胞翻譯合成Cas9蛋白，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因編輯。

(3) 蛋白瞬轉(zhuǎn)(RNP)：體外將Cas9蛋白和sgRNA混合，二者可以結(jié)合形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)，然后通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)(脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)等)可將RNP復(fù)合效應(yīng)物遞送到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的編輯。

根據(jù)遞送形式以及不同的細(xì)胞，可以選擇不同的遞送方法，主要包括：物理方法、化學(xué)方法、以及病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中，利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒和電穿孔遞送RNP是將CRISPR/Cas9導(dǎo)入細(xì)胞的兩種主要方法。

CRISPR/Cas9技術(shù)的常規(guī)應(yīng)用

基因敲除

在基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，在通常情況下，細(xì)胞會(huì)采用高效的非同源末端連接方式(NHEJ)對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。

基因敲入、定點(diǎn)突變

在上下游DNA雙鏈斷裂基礎(chǔ)上，引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)(供體DNA分子)，基因組斷裂部分會(huì)依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)(HDR)，細(xì)胞按照提供的模板在修復(fù)過(guò)程中引入片段插入或定點(diǎn)突變。

基因抑制、基因激活

Cas9的特點(diǎn)是能夠自主結(jié)合和切割目的基因，通過(guò)點(diǎn)突變的方式使Cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始，從而抑制基因表達(dá)；將dCas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會(huì)對(duì)基因組DNA造成永久性的改變。

多重編輯（Multiplex Editing）及功能基因組篩選

將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯，具有基因組功能篩選作用。

利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞，因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的。目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對(duì)表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對(duì)化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫(kù)對(duì)潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。

高效的基因編輯工具-?Cas9核酸酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

Cas9蛋白的編碼框長(zhǎng)達(dá)4kb，將Cas9基因高效導(dǎo)入細(xì)胞是應(yīng)用CRISPR/cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的難點(diǎn)之一，Cas9基因的長(zhǎng)度極大地限制了基因?qū)爰?xì)胞方法的選擇以及基因敲除的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

將Cas9核酸酶基因穩(wěn)定整合到指定的宿主細(xì)胞基因組上，保證該基因表達(dá)的可靠性以及持續(xù)性。為CRISPR/cas9基因組編輯應(yīng)用提供一個(gè)方便、高效的工具。

Cas9核酸酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系應(yīng)用

01

高通量篩選

sgRNA高通量篩選，功能驗(yàn)證，確定sgRNA編輯效率；

02

基因編輯模型

轉(zhuǎn)染sgRNA或同時(shí)轉(zhuǎn)染sgRNA和供體DNA，實(shí)現(xiàn)基因敲除\基因敲入\點(diǎn)突變；

03

基因功能研究

可用于長(zhǎng)期在某一類(lèi)細(xì)胞中研究不同基因的生物學(xué)功能。

吉滿生物科技（上海）有限公司成立于2011年，是專(zhuān)業(yè)從事生物科技前沿技術(shù)研發(fā)的高新技術(shù)企業(yè)。以病毒包裝為基礎(chǔ)，密切關(guān)注行業(yè)最前沿的科研進(jìn)展，十一年深耕細(xì)作，創(chuàng)建了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、慢病毒、腺相關(guān)病毒、報(bào)告基因、抗體表達(dá)六大技術(shù)平臺(tái)。

2020年成立了專(zhuān)業(yè)細(xì)胞系子品牌DDXCELL，提供報(bào)告基因檢測(cè)、病毒包裝、工程細(xì)胞株構(gòu)建，基因編輯及藥物篩選評(píng)價(jià)等技術(shù)服務(wù)及相關(guān)產(chǎn)品。

2022年載體品牌“載體通·Genovector”煥新升級(jí)，同時(shí)推出全新試劑品牌“優(yōu)試劑·Genoagent”，貫穿科研始末。

吉滿可為客戶提供幾千種的現(xiàn)貨載體和一站式定制服務(wù)。