? ? ? ?細(xì)菌II型分泌系統(tǒng)(T2SS)廣泛存在于多種變形菌中，包括非致病性大腸桿菌(E. coli)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌（EPEC）等。T2SS底物在非致病菌中可促進(jìn)細(xì)菌從環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質(zhì)或與植物、動(dòng)物共生；而在致病菌中，T2SS底物可幫助粘附宿主，使宿主細(xì)胞中毒，抑制宿主免疫功能，引起多種疾病。由于T2SS底物功能多樣，且與毒力和疾病密切相關(guān)，因此了解其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制對(duì)了解細(xì)菌功能和制定抗菌策略是十分必要的。

? ? ? ?徐州醫(yī)科大學(xué)石小東課題組在nature communications發(fā)表了題為Membrane translocation process revealed by in situ structures of type II secretion system secretins（IF=16.6）的研究論文，該研究采用冷凍斷層三維成像技術(shù)（cryo-ET）,在野生型及敲除GspS蛋白的大腸桿菌（由源井生物構(gòu)建）中，解析了大腸桿菌T2SS兩種類型分泌素（克雷伯菌型分泌素GspDα和弧菌型分泌素GspDβ）的原位結(jié)構(gòu)，并分別揭示出這兩種分泌素的易位機(jī)制[1]。

? ? ? ?作者首先對(duì)過表達(dá)GspDα的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行cryo-ET成像，但只在細(xì)菌內(nèi)膜上觀察到GspDα多聚體的顆粒，其俯視圖和側(cè)視圖均清晰可見(圖1a-d) 。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，并非所有GspDα顆粒都是垂直插入內(nèi)膜的，有些GspDα顆粒則是以一定的傾斜角度插入內(nèi)膜(圖1e-g)。作者一共框出32,000個(gè)在內(nèi)膜上的GspDα顆粒，通過采用C15對(duì)稱性進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，最終解析出GspDα在內(nèi)膜上分辨率為9??的原位結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)中，可以清晰地識(shí)別出N0-N3結(jié)構(gòu)域，其中的N0結(jié)構(gòu)域在GspDα的冷凍電鏡單顆粒結(jié)構(gòu)中是缺失的。最為重要的是，原位結(jié)構(gòu)顯示，GspDα在內(nèi)膜上以兩種不同的構(gòu)象存在（圖2b-c）。通過對(duì)GspDα在內(nèi)膜上的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析，作者推測(cè)其可以圍繞膜接觸點(diǎn)在一定范圍內(nèi)擺動(dòng)，即GspDα可以在兩種構(gòu)象之間轉(zhuǎn)換。這些結(jié)果表明，在內(nèi)膜上的GspDα多聚體處于一種可活動(dòng)的、不穩(wěn)定的狀態(tài)，有助于其進(jìn)一步被運(yùn)輸?shù)酵饽ぁ?/span>

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? ? ?? 為了證實(shí)是否由于肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑太小，使得GspDα多聚體無法通過并轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜，而是附著于內(nèi)膜上，作者通過減少肽聚糖交聯(lián)來研究其對(duì)GspDα外膜靶向的影響。先前的研究表明，大腸桿菌在含有高濃度D-蛋氨酸的培養(yǎng)基中生長會(huì)降低肽聚糖的交聯(lián)，因此，作者在對(duì)D-蛋氨酸處理之后的GspDα過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行了cryo-ET成像。結(jié)果顯示，D-蛋氨酸處理成功使得部分GspDα顆粒出現(xiàn)在外膜上(圖1h)。作者收集了在外膜上的GspDα顆粒進(jìn)行了數(shù)據(jù)計(jì)算，解析出GspDα在外膜上的原位結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，GspDα在外膜上只有一種構(gòu)象，和外膜形成均勻分布的連接（圖2a）。

? ? ? ?GspDβ作為GspDα的同源物，其結(jié)構(gòu)與GspDα相似，但膜的鄰近側(cè)有兩處不同，可能會(huì)產(chǎn)生不同的跨膜區(qū)域和膜相互作用。此外，GspDβ具有不同的外膜靶向機(jī)制，稱為先導(dǎo)蛋白的GspS可以結(jié)合到GspDβ的S結(jié)構(gòu)域，并將GspDβ轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜。因此，為了在外膜上觀察GspDβ顆粒并驗(yàn)證GspS是否與GspDβ形成復(fù)合體，作者進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。一種是在野生型大腸桿菌迷你細(xì)胞中誘導(dǎo)GspDβ和GspS表達(dá)，另一種是僅誘導(dǎo)GspDβ表達(dá)。

? ? ? ? 研究結(jié)果顯示，同時(shí)過表達(dá)GspDβ和GspS之后，GspDβ顆粒位于外膜上(圖3a)，通過對(duì)514這樣的顆粒采用C15對(duì)稱性進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，發(fā)現(xiàn)GspS電子密度包圍在GspDβ外側(cè)，表明二者在外膜上以GspDβ-GspS復(fù)合體的形式存在(圖3b)。當(dāng)僅誘導(dǎo)GspDβ表達(dá)時(shí)，絕大部分GspDβ顆粒位于細(xì)菌的外膜上(圖3c)，少部分GspDβ顆粒位于細(xì)菌的內(nèi)膜上(圖3d)。通過挑選外膜上的顆粒進(jìn)行計(jì)算，解析出來的結(jié)構(gòu)依然是GspDβ-GspS復(fù)合體。上述這些結(jié)果表明，當(dāng)GspS與GspDβ一起過表達(dá)時(shí)，它們?cè)谕饽ど闲纬蓮?fù)合體。在不表達(dá)外源GspS的情況下，僅過表達(dá)GspDβ時(shí)，大腸桿菌內(nèi)源性的GspS足以將GspDβ定位到外膜，然后附著在GspDβ上。

? ? ? ?之前的生物化學(xué)研究結(jié)果表明，當(dāng)GspS被敲除后，GspDβ會(huì)在細(xì)菌內(nèi)膜上形成多聚體。為了在內(nèi)膜上看到GspDβ，作者在敲除GspS的大腸桿菌細(xì)胞中過表達(dá)了GspDβ。結(jié)果顯示，GspDβ顆粒全部出現(xiàn)在內(nèi)膜上（圖3f），在其原位結(jié)構(gòu)中，觀察不到GspS密度（圖3g）。這些結(jié)果表明，當(dāng)GspS被敲除后，GspDβ可以在細(xì)菌內(nèi)膜上自組裝成具有穩(wěn)定構(gòu)象的多聚體。

? ? ? ?這項(xiàng)研究捕獲到大腸桿菌T2SS兩種分泌素在膜易位過程中的原位結(jié)構(gòu)，揭示出兩種不同的分泌素易位機(jī)制，增加了對(duì)T2SS分泌素的膜相互作用及其膜易位過程的認(rèn)識(shí)，為分泌素生物生成過程提供了新的視角。

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Yu Z, Wu Y, Chen M, et al. Membrane translocation process revealed by in situ structures of type II secretion system secretins[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 4025.