壞死的研究比較少見，目前對于壞死和體內(nèi)壞死反應的理解仍然有限。在這里，作者發(fā)現(xiàn)了一個分子開關，促進了肝細胞中兩種可供選擇的壞死信號傳導模式之間的重新編程，從根本上影響了免疫反應和肝癌的發(fā)生。肝細胞生理上表達低濃度的受體交互激酶3（RIPK3），同時激活壞死體和NF-κB并不導致細胞立即死亡，而是迫使它們進入長時間的“亞致命”狀態(tài)，具有漏膜功能，作為釋放特定趨化因子的分泌細胞，包括CCL20和MCP-1。這引發(fā)了肝細胞增殖以及致癌單核細胞衍生的巨噬細胞群的激活，促成了肝癌的發(fā)生。相反，當肝細胞中的NF-κB信號不活躍時，壞死體的激活引起了壞死性的加速執(zhí)行，限制了報警素的釋放，從而防止了炎癥和肝癌的發(fā)生。一致地，瘤內(nèi)NF-κB-壞死性特征與人類肝癌發(fā)生的不良預后有關。因此，在這些不同形式的壞死循環(huán)之間進行藥理重編程可能代表了一種有前途的防治肝細胞癌的策略。

▉結果：

1.肝實質細胞的慢性細胞壞死與肝膽結構重塑相關

在肝實質細胞LPCΔTraf2(LPC)小鼠中敲除了Traf2--E3-泛素連接酶cIAP1和cIAP218的適配器蛋白，誘導細胞凋亡，誘導肝炎。組織學分析顯示，LPCΔTraf2肝臟的一些門靜脈有明顯的管狀反應，但沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的異常。此外，LPCΔTraf2的肝臟顯示出自發(fā)的肝細胞凋亡。細菌脂多糖（LPS）處理誘導LPCΔTraf2明顯的細胞凋亡和肝臟損傷，但WT肝臟沒有。用重組TNF分離和刺激LPCΔTraf2小鼠的原發(fā)性肝細胞，這導致細胞凋亡的強烈激活，以及MLKL的輕微磷酸化，作為TRAF2缺陷的肝細胞壞死激活的替代物。

為了從功能上剖析Traf2缺失背景下壞死吞噬和凋亡的具體作用，在LPCΔTraf2小鼠中消減了Casp8，以阻止凋亡的激活（LPCΔTraf2，Casp8小鼠）。正如預期的那樣，只在LPCΔTraf2小鼠的肝細胞中檢測到caspase-3裂解，而在LPCΔTraf2, Casp8小鼠中沒有檢測到。與LPCΔTraf2小鼠相比，LPCΔTraf2、Casp8小鼠的肝細胞損傷標志物明顯減少，表明LPCΔTraf2小鼠的肝損傷部分是由細胞凋亡引起的。然而，LPCΔTraf2, Casp8小鼠仍顯示ALT和AST濃度增加，表明肝臟損傷仍然存在。

為了評估LPCΔTraf2, Casp8小鼠壞死的激活情況，顯示RIPK3的低表達（圖1A）。與免疫細胞相比，RIPK3在WT肝臟的肝細胞中只有微弱的表達，在LPCΔTraf2和LPCΔTraf2, Casp8小鼠的肝細胞中略有增加，但仍然低于免疫細胞和膽汁細胞（圖1B）。

與原代肝細胞中RIPK3的低表達相一致，在沒有和有外源性TNF的情況下都檢測到MLKL的低磷酸化（圖1A）。值得注意的是，LPCΔTraf2、Casp8肝細胞顯示Tnf mRNA表達增加，這可能有助于MLKL在未經(jīng)處理的肝細胞中長期磷酸化。為了進一步研究TNF在LPCΔTraf2, Casp8小鼠肝損傷中的作用，用TNF抑制劑etanercept治療LPCΔTraf2, Casp8小鼠2周。這個實驗并沒有導致肝臟損傷的明顯改善。

在組織學上，6周大的LPCΔTraf2, Casp8小鼠顯示出嚴重的自發(fā)性肝臟表型，有晚期纖維化和門靜脈橋接（圖1C）。對年輕小鼠的分析顯示，在出生后第1天組織學正常，證明LPCΔTraf2, Casp8小鼠的胚胎發(fā)育有缺陷。值得注意的是，在21天大的小鼠中已經(jīng)檢測到門靜脈橋接（圖S2H）。6周齡小鼠的免疫組化特征顯示，天狼星紅陽性的纖維間隔包含α-SMA陽性的活化肝星狀細胞，以及突出的泛細胞角蛋白（CK）和SOX9陽性、A6陰性的導管反應（圖1C）。CK19染色的三維表面重構顯示了膽道結構改變（圖1D）。一致的是，LPCΔTraf2, Casp8小鼠血清中的膽紅素和堿性磷酸酶（AP）的濃度升高（圖1E）。IHC染色顯示，混合口間浸潤含有多種免疫細胞（圖1C）。在對全肝蛋白提取物進行的免疫印跡分析中，LPCΔTraf2, Casp8肝臟中的免疫細胞浸潤與TRAF2和caspase-8的表達增加有關。然而，對6-8周齡小鼠肝臟切片的IHC分析顯示，Caspase-8只在非血小板細胞中表達，而在LPCΔTraf2、Casp8小鼠的肝細胞中不存在。同樣，對來自6-12周齡小鼠的分離和純化的肝細胞的RNA提取物進行qRT-PCR分析，證實LPCΔTraf2, Casp8小鼠的初級肝細胞中Traf2和Casp8缺失。最后，LPCΔTraf2, Casp8的肝臟顯示出細胞增殖的增加（圖1F-1H）?？傊?，LPC中Traf2和Casp8的共同缺失與肝膽結構的重塑有關，其特點是大量的炎癥、纖維化和肝臟 - 脈管細胞增生。

2.LPCΔTraf2, Casp8小鼠壞死通路的慢性激活驅動肝癌發(fā)生

在52周齡時，所有的LPCΔTraf2、Casp8小鼠（13/13），但沒有任何LPCΔTraf2（0/6）或WT（0/9）小鼠出現(xiàn)多個肝臟腫瘤和肝臟與體重的比率增加（圖2A），作為惡性腫瘤的標志。組織學上，這些腫瘤顯示出HCC的特征，如H&E、IV型膠原蛋白的損失和GP73染色增加（圖2B和2C）。為了測試LPCΔTraf2, Casp8小鼠的癌癥發(fā)展是否是由壞死作用介導的，將LPCΔTraf2, Casp8小鼠與Ripk3-/-動物（LPCΔTraf2, Casp8-Ripk3-/-小鼠）雜交。值得注意的是，LPCΔTraf2, Casp8-Ripk3-/-小鼠在52周歲時沒有顯示出腫瘤發(fā)展的跡象（0/11）（圖2D）。對LPCΔTraf2, Casp8小鼠的肝臟腫瘤進行了陣列式CGH分析，并比較了LPCΔTraf2和LPCΔTraf2, Casp8-Ripk3-/-小鼠的染色體畸變模式與微結構紊亂的區(qū)域（圖2E）。該分析顯示，LPCΔTraf2、Casp8小鼠的HCC顯示出多種基因的增加和損失，而在LPCΔTraf2和LPCΔTraf2、Casp8-Ripk3-/-小鼠的肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)基因改變。為了證實LPC的壞死信號是LPCΔTraf2, Casp8小鼠癌癥表型的驅動因素，將LPCΔTraf2, Casp8小鼠與Mlkl-floxed小鼠（LPCΔTraf2, Casp8, Mlkl小鼠）以及Ripk1-floxed小鼠（LPCΔTraf2, Casp8, Ripk1小鼠）21交叉。值得注意的是，額外的Mlkl缺失以及Ripk1缺失導致對LPCΔTraf2、Casp8表型的類似拯救，如Ripk3缺失所示（圖2F）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，RIPK1-RIPK3-MLKL依賴的壞死信號促進了LPCΔTraf2, Casp8小鼠的肝癌發(fā)生。

3.NF-κB的激活是壞死性肝癌發(fā)生的先決條件

RIPK3促進了LPCΔTraf2, Casp8小鼠的炎癥和肝癌的發(fā)生，這與以前在LPC中遺傳消減激酶Tak1（LPCΔTak1）的小鼠中的發(fā)現(xiàn)相沖突，其中RIPK3由于一個未知的機制而抑制了肝癌的發(fā)生。TAK1是激活催化型IKK亞基所必需的，而缺乏Tak1的LPC顯示出NF-κB激活的完全阻斷。相比之下，以前已經(jīng)表明，小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中TRAF2的缺失導致NF-κB的構成性過度激活。通過EMSA證實LPCΔTraf2小鼠的肝臟和初級肝細胞中NF-κB過度激活。因此假設IKK復合物和NF-κB途徑的激活狀態(tài)可能決定RIPK3依賴的壞死是促進還是抗腫瘤的。

為了驗證這一假設，將LPCΔTraf2、Casp8小鼠與Ikbkbfloxed（Ikkβ）小鼠雜交，產(chǎn)生LPCΔTraf2、Casp8、Ikbkb小鼠（圖S3C）。正如預期的那樣，通過EMSA（圖3A）和全肝提取物中NF-κB靶基因A20的表達分析（圖3B和3C），Ikkβ的額外缺失抑制了LPCΔTraf2、Casp8小鼠的原發(fā)性肝細胞中自發(fā)的和TNF誘導的NF-κB激活。Ikkβ的額外消融挽救了6周大的LPCΔTraf2, Casp8小鼠的導管反應表型（圖3D）。然而，年輕的LPCΔTraf2, Casp8, Ikbkb小鼠顯示存在局灶性肝細胞壞死病變（圖3D）。這些壞死病變伴隨著肝臟酶的上升，作為肝臟損傷增加的代名詞，但膽汁淤積參數(shù)減少。值得注意的是，在52周大的LPCΔTraf2、Casp8、Ikbkb小鼠中沒有檢測到肝臟腫瘤（0/11）（圖3D）。然而，對老的LPCΔTraf2, Casp8, Ikb小鼠的顯微切割、組織學干擾區(qū)域的陣列-CGH分析顯示，仍然可以檢測到染色體畸變，但其程度比LPCΔTraf2, Casp8小鼠的腫瘤中的畸變要?。▓D3E）。

IKKs被認為是以NF-κB無關的方式調(diào)節(jié)RIP激酶活性的。因此，為了排除IKKβ獨立于NF-κB的功能介導了LPCΔTraf2, Casp8小鼠的表型，通過替代靶向方法抑制NF-κB。調(diào)節(jié)性IKK亞單位Nemo（LPCΔTraf2, Casp8, Ikbkg）或NF-κB亞單位Rela（p65）（LPCΔTraf2, Casp8, Rela）的額外消融導致了類似于額外Ikkβ消融后的表型逆轉（圖3F），證明了NF-κB信號的關鍵功能，并反對IKKβ在調(diào)解LPCΔTraf2, Casp8小鼠的壞死性致癌過程中具有不依賴NF-κB的作用。值得注意的是，在NF-κB被抑制的情況下，所有額外的自發(fā)性壞死激活的遺傳基因座（LPCΔIkbkg、Casp8、LPCΔTak1、Casp8）顯示出與先前在LPCΔTraf2、Casp8、Ikb小鼠中檢測到的壞死區(qū)域相似，但被從癌癥發(fā)展中逆轉。

由于TRAF2信號傳導受損也被認為與非經(jīng)典NF-κB信號的激活有關，在原代肝細胞和肝臟提取物中通過免疫印跡測試p100的表達和裂解為p52。在LPCΔTraf2、Casp8和LPCΔTraf2、Casp8-Ripk3-/-小鼠的肝細胞和肝臟中，裂解為p52形式，但在WT小鼠中沒有（圖3G）。此外，Ikkβ的額外缺失廢除了p100的表達，導致這些小鼠中沒有p52的裂解形式（圖3G）。這一發(fā)現(xiàn)證實了典型和非典型NF-κB信號之間的功能相互聯(lián)系?？偟膩碚f，這些結果表明，在具有激活壞死的肝細胞中，NF-κB的失活導致了壞死灶的形成，但沒有發(fā)展成HCC。相比之下，在壞死性信號激活的肝細胞中，NF-κB的過度激活促進了細胞的過度增殖和HCC的發(fā)展。

隨即在臨床相關性上，作者發(fā)現(xiàn)NF-kb介導的壞死特征與肝癌病人的臨床預后相關。

壞死小體的活化誘導肝臟實質細胞釋放趨化因子和細胞因子的先決條件。

激活NF-kb和壞死體協(xié)同誘發(fā)肝臟浸潤與單核細胞源性巨噬細胞的順應性和致癌亞群。

體內(nèi)NF-kb的激活迫使體內(nèi)壞死的肝臟細胞進入亞致死狀態(tài)。