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Identification of Molecular Subtypes and a Prognostic Signature Based on Inflammation-Related Genes in Colon Adenocarcinoma
Chenjie Qiu,?1 ,???Wenxiang Shi,?2 ,???Huili Wu,?3 ,???Shenshan Zou,?1?Jianchao Li,?1?Dong Wang,?1?Guangli Liu,?1?Zhenbiao Song,?1?Xintao Xu,?1?Jiandong Hu,
摘要：
腫瘤浸潤免疫細胞和可介導免疫浸潤的炎癥相關基因都有助于結腸癌患者的發(fā)生和預后。在這項研究中，我們開發(fā)了一種方法來預測結腸癌患者的生存結果以及直接免疫療法和化學療法。我們從癌癥基因組圖譜 (TCGA) 獲得患者數(shù)據(jù)，并從 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中捕獲炎癥相關基因。“ConsensusClusterPlus”包用于根據(jù)通過差異表達分析和單變量Cox分析獲得的炎癥相關基因生成分子亞型。還構建了包括四個基因（PLCG2、TIMP1、BDNF 和 IL13）的預后特征，并且是獨立的預后因素。集群 2 和更高的風險評分意味著更差的總體存活率以及人類白細胞抗原和免疫檢查點的更高表達。還根據(jù)炎癥相關分子亞型和風險特征比較了通過估計、CIBERSORT、TIMER、ssGSEA 算法、腫瘤免疫功能障礙和排除 (TIDE) 和腫瘤干性指數(shù) (TSI) 計算的免疫細胞浸潤。此外，基于風險特征進行分層、體細胞突變、列線圖構建、化療反應預測和小分子藥物預測的分析。我們最終使用qRT-PCR檢測了結腸癌細胞系中四個基因的表達水平，并獲得了與預測一致的結果。
結果
基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，獲得357個炎癥相關基因，篩選標準為蛋白質編碼基因，相關性得分大于5。本研究的主要流程見。隨后，通過對COAD和正常結腸組織的差異分析，獲得了66個上調基因和54個下調基因。?。GO和KEGG通路富集分析表明，上述差異表達基因主要富集在免疫、炎癥、細胞因子-細胞因子受體和腫瘤相關的生物學功能和信號通路中。此外，還顯示了前 10 個上調和下調基因之間的相關性。使用 STRING 數(shù)據(jù)庫探索 PPI 網(wǎng)絡并使用 Cytoscape 進行可視化。排名前十的hub基因通過度數(shù)排序得到。
(A) COAD 中 66 個上調和 54 個下調 IRG 的火山圖（FDR < 0.05 和 |logFC| > 1）。(B)正常結腸和 COAD 組織之間 120 個 DE-IRG 的熱圖。(C) GO 分析中的前十個豐富術語屬于 DE-IRG 的 BP、CC 和 MF。(D) KEGG 分析中的前 30 個豐富術語。(E)前十名上調和下調的 IRGs 之間的相關性。(F)根據(jù) STRING 數(shù)據(jù)庫的 DE-IRG 的 PPI 網(wǎng)絡。(G)從“cytohubba”插件獲得的中樞基因。（你好）從“MCODE”插件獲得的兩個模塊。IRGs，炎癥相關基因；COAD，結腸腺癌；FDR，錯誤發(fā)現(xiàn)率；FC，倍數(shù)變化；DE-IRGs，差異表達的 IRGs；GO，基因本體論；BP，生物過程；CC，單元組件；MF，分子功能；KEGG，京都基因和基因組百科全書；PPI，蛋白質-蛋白質相互作用。炎癥相關簇的鑒定以及簇與腫瘤免疫微環(huán)境、腫瘤發(fā)生評分和 TSI 之間的相關性分析
通過單因素 Cox 分析，我們獲得了 10 個與預后相關的基因，其中 IL13 是保護因素，其他 9 個基因是危險因素相關分析表明，大多數(shù)基因相互關聯(lián)。十個預后相關基因進一步用于聚類分析。COAD患者聚類成兩個亞組時聚類效果最好，亞組內部一致性和穩(wěn)定性較好。生存分析顯示集群 1 的預后優(yōu)于集群 2。熱圖揭示了2個簇之間的基因表達差異，并與臨床病理參數(shù)如分期、T分期和N分期顯著相關。
隨后，各種算法被用來分析兩個集群之間免疫浸潤的差異。我們發(fā)現(xiàn)兩個集群之間的免疫細胞和免疫相關功能或途徑存在顯著差異。TIMER 算法顯示，Cluster 2 與更多的免疫細胞浸潤有關，例如 CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。CIBERSORT 算法揭示了類似的結果（。ESITIMATE 算法顯示，Cluster 2 具有較高的免疫評分、基質評分、ESITIMATE 評分和較低的腫瘤純度。我們還發(fā)現(xiàn)簇 2 與許多 MHC 分子的高表達有關。
此外，Cluster 2 中的血管生成活性、間充質 EMT、致瘤細胞因子和干性評分顯著更高。桂等人。發(fā)現(xiàn)缺氧免疫風險評分與 EREG-mRNAsi 和 ENHsi 呈負相關。較高的 EREG-mRNAsi 和 ENHsi 水平意味著更好的預后 (?10?)。在這項研究中，發(fā)現(xiàn)集群 2 與較低的 TSI 相關。
因為這兩個集群在免疫浸潤方面存在顯著差異，我們評估了與五個常見免疫檢查點的相關性。簇 2 的 PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3 和 PD1 表達較高。集群 2 與更高的 TIDE 評分相關。
(A)通過單變量 Cox 分析得出的十個與預后相關的 DE-IRG 的森林圖。(B)十個基因之間的相關性。(C) k = 2 時的共識聚類矩陣。(D) k 值為 2 至 9 的共識聚類 CDF。(E) k = 2 時 CDF 曲線下面積的相對變化。(F)聚類間生存差異的 KM 曲線1和簇2。（G）兩個簇之間的十個基因的熱圖以及簇和臨床參數(shù)的相關性。使用 CIBERSORT (H)進行免疫細胞浸潤，使用 ESTIMATE (I)進行免疫和基質評分，MHC 分子的表達(J)、血管生成活性、間充質-EMT、致瘤細胞因子和干性評分（K）、五種常見免疫抑制劑（L）和兩個集群之間的TIDE評分（M） 。構建炎癥相關簽名和基于簽名的列線圖
(A)通過多變量 Cox 分析在簽名中選擇的四個基因的森林圖。(B)簽名中包含的四個基因的系數(shù)。(C)簽名與四個基因之間的相關性。(D)四種基因表達水平與臨床病理學特征之間關聯(lián)的熱圖。TCGA 隊列(E)和GSE17538隊列(F)中的生存分析、熱圖、生存狀態(tài)以及風險評分和 ROC 分析。根據(jù)單變量(G)和多變量 Cox 分析(H) ，該特征是 TCGA 隊列中 COAD 患者的獨立危險因素. 根據(jù)臨床病理特征，如集群（I）、腫瘤分期（J）、淋巴結狀態(tài)（K）和轉移（L） ，不同組之間風險評分的差異。(M)基于風險評分和年齡的列線圖。(N)用于預測 3.5 年、5 年和 7.5 年生存概率的列線圖的校準圖。ROC，接收器操作特性；TCGA，癌癥基因組圖譜。根據(jù)簽名估計腫瘤免疫細胞浸潤和免疫檢查點抑制劑
(A)與腫瘤發(fā)展和進展相關的途徑在高危人群中豐富。(B) JAK-STAT 信號通路是高危組中最相關的 KEGG 通路。(C)與免疫、趨化因子和 MHC 分子相關的多重途徑在高風險組中富集。免疫細胞浸潤和免疫相關功能或途徑(D)、免疫和基質評分(E)、免疫細胞浸潤使用 TIMER (F)和 CIBERSORT (G)、MHC 分子表達水平(H)、五種常見免疫抑制劑(I)和潮汐分數(shù)(J)在高風險和低風險人群之間。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不顯著）。(A)與腫瘤發(fā)展和進展相關的途徑在高危人群中豐富。(B) JAK-STAT 信號通路是高危組中最相關的 KEGG 通路。(C)與免疫、趨化因子和 MHC 分子相關的多重途徑在高風險組中富集。免疫細胞浸潤和免疫相關功能或途徑(D)、免疫和基質評分(E)、免疫細胞浸潤使用 TIMER (F)和 CIBERSORT (G)、MHC 分子表達水平(H)、五種常見免疫抑制劑(I)和潮汐分數(shù)(J)在高風險和低風險人群之間。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不顯著）。血管生成活性、間充質 EMT、致瘤細胞因子、干性評分和 TSI 與簽名的相關性
(A)與血管生成、EMT、細胞因子-細胞因子受體相互作用和干性相關的通路在高危人群中富集。(B)高危組和低危組之間血管生成活性、間充質-EMT、致瘤細胞因子和干性評分的差異。(C)風險評分與血管生成活性、間充質-EMT、致瘤細胞因子和干性評分的相關性。(D)兩組間 TSI 的差異。TSI，腫瘤干性指數(shù)。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不顯著）。
高危組（A）和低危組（B）體細胞突變的瀑布圖。高風險組(C)和低風險組(D)中不同突變基因的共現(xiàn)和互斥突變的熱圖。*p < 0.01。(E)高風險組和低風險組之間的 TMB 比較。(F)高 TMB 組和低 TMB 組之間的總生存期差異。(G)基于 TMB 和風險評分的總生存期差異。(H)來自 cBioPortal 數(shù)據(jù)庫的 COAD 患者中四種基因（TIMP1、IL13、PLCG2、BDNF）的突變率。（ns，不顯著）。
(A)高危組和低危組常用化療藥物化療反應的差異。(B)高風險組和低風險組之間的差異表達基因。(C)從 cMap 數(shù)據(jù)庫中篩選出的六種潛在靶標藥物的 3D 結構。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；NS，不顯著）。PLCG2、TIMP1、BDNF和IL13在不同結腸癌細胞系中的表達
通過qRT-測量不同細胞系（NCM460、HCT116、SW480、HT29、LOVO、RKO、DLD-1）中TIMP1 （A）、IL13 （B）、BDNF （C）和PLCG2 （D）的mRNA表達水平聚合酶鏈反應。將結果標準化為參考基因 GAPDH。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM，雙尾非配對t檢驗用于每個標記的統(tǒng)計計算，n = 3個獨立實驗。（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，不顯著）。結論
總之，本研究根據(jù)結腸癌中的 IRGs 確定了分子亞型，并使用 IRGs 構建了預后特征。還分析了不同分子亞型和不同風險組之間的免疫情況、基因突變狀態(tài)和藥物敏感性。該簽名可能為臨床判斷預后和藥物治療提供證據(jù)。
標簽：
