01蛋白提取

? 細胞樣品在提取前需要使用PBS清洗兩遍，以減少培養(yǎng)基對樣品的干擾，懸浮細胞可500Xg低速離心后收集進行蛋白提取。貼壁細胞可在培養(yǎng)器皿中直接進行蛋白提取。蛋白提取前建議進行細胞計數(shù)，以確定提取中添加裂解液的比例，得到最佳提取效率。

? 組織樣品在提取前也需要用PBS清洗，一些含血量豐富的組織，建議使用紅細胞破裂液去除紅細胞，以避免血液中IgG對后續(xù)實驗的影響。

? 為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的。

? 在提取蛋白的時候僅僅靠裂解液有時候也不能達到完全抽提的效果，有條件的話，可以對抽提懸液進行超聲破碎處理；超聲的時候，因為超聲發(fā)熱損傷蛋白，需要把要超聲的樣本放到冰水混合物里。

? 此外如果沒有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替來抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過抽提后的樣本不能進行濃度測定。

? 蛋白煮沸變性一般是95-100°C，5-10min，水浴鍋煮沸時，可用帶夾EP管防止EP管蓋彈開，使水浴鍋內(nèi)的水進入而使樣品廢掉。

02蛋白電泳

正確選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區(qū)域最大限度的分離開，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降到最低；目的蛋白分子量與膠濃度的選擇見下表：

蛋白質(zhì)分子量范圍(KD)

凝膠濃度(%)

<10

15

10-30

12

30-100

10

100-500

8

>500

6

采用SDS-PAGE電泳，每孔上樣等體積總蛋白，上樣時，先加marker，如有空置的加樣孔，須加等體積的1×loading buffer，以防相鄰泳道樣品的擴散。開始電壓為80V，使樣品跑得慢一些，充分濃縮，到達分離膠后調(diào)為120V，電泳至溴酚藍要跑出即可終止電泳。關于電泳液，建議新鮮配制，也可先配10x的，然后現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。

Tips：蛋白電泳

1、玻璃板清洗后，為了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置幾分鐘，拿出來的時候后需平衡至室溫再灌膠，不然很容易產(chǎn)生氣泡；

2、配膠用的試劑一般都是在4度冰箱保存，當我們按比例配好混合液的時候，要等混合液恢復室溫時，再灌膠，不然也很容易產(chǎn)生氣泡；

3、?玻加水液封時，速度要慢，可用1ml槍沿著膠板上沿反復移動，不然很容易將分離膠沖變形；

4、?梳子注意和玻璃板匹配，1.5mm的梳子很難插進1mm的玻璃板中，暴力插入會破壞膠板；如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中，由于中間有空隙，就會有膠凝固在里面；

5、?濃縮膠凝好可以泡到電泳緩沖液里，比較容易拔出。

?

03蛋白轉膜?膜的選擇

1、現(xiàn)在用的最多的是PVDF膜，用之前需注意：

1）先在純甲醇中浸濕膜15s，保證PVDF膜充分活化；

2）將膜放入轉膜緩沖液中平衡至少5min；

2、?NC膜不需要甲醇活化。

膜的孔徑

1、?根據(jù)被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的印跡膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固；

2、?通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的印跡膜。大于20KD的蛋白可用0.45μm 的膜，小于20KD的蛋白就要用0.2μm的膜。

小分子蛋白

1、小分子蛋白很容易轉過，所以摸索適合自己蛋白的轉膜條件很重要，這一步很難說一次就成功，所以剛開始的時候可以在接觸膠面的PVDF膜上再放一張PVDF膜，轉膜結束后，立春紅染色，觀察使用的條件是否會轉過頭；

2、?小分子蛋白轉膜液中一定不要加SDS，因為SDS會影響轉膜效果；

3、?小分子蛋白濕轉參考100V恒壓，或者150-200恒流，40-60min，都可以跑出來結果，同時也可以保證內(nèi)參的效果很好；

4、?小分子蛋白轉膜液甲醇濃度為20%；

5、?分子量小于10 kDa的多肽或蛋白，建議使用Tricine-SDS-PAGE電泳和轉膜系統(tǒng)。

大分子蛋白

1、?轉膜時間要適當延長，220V，300mA，濕轉，建議時間在2h30min-3h，因為轉膜時間很長，可以預冷轉膜緩沖液，同時提前準備好足夠的冰袋降溫；

2、?轉膜液中可以加入適量SDS（濃度0.1%），對于大分子量蛋白加入SDS是為了增加了蛋白表面電荷，從而增加轉膜效率；

3、?大分子蛋白轉膜液甲醇濃度為5%。

04印跡膜封閉

1、?脫脂奶是最常用的經(jīng)濟配方。

2、?脫脂奶粉不能與生物素化的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建議使用BSA。

3、?分析磷酸化蛋白須用BSA。脫脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化;也不適用于堿性磷酸酶(AP)檢測系統(tǒng)。

4、?如果用辣根過氧化物酶(HRP)檢測系統(tǒng)，封閉液不應加疊氮鈉(NaN3)，因為疊氮鈉對辣根過氧化物酶（HRP）有滅活作用。

5、?如果用二抗抗體是堿性磷酸酶(AP)標記的檢測系統(tǒng)，可使用酪蛋白封閉，同時須選擇TBS緩沖溶液，不可使用PBS緩沖溶液，因為PBS緩沖溶液干擾堿性磷酸酶。

05一抗二抗孵育

1、?建議孵育抗體之前一定要仔細看抗體說明書，了解抗體的種屬來源和抗體的建議稀釋比例。

2、?選擇二抗抗體取決于一抗抗體的動物來源。例如,如果一抗抗體是小鼠來源單克隆抗體,二抗抗體必須是抗小鼠的抗體；如果一抗抗體是兔來源多克隆抗體、二抗抗體必須是抗兔的抗體。

3、?建議使用商品化的抗體稀釋液稀釋一抗二抗，不僅能有效減少一抗或二抗的非特異性結合，并有效提升稀釋后抗體的穩(wěn)定保存時間，可重復利用。

06顯影成像

1、建議使用高信號強度、高靈敏度、高穩(wěn)定性的ECL化學發(fā)光試劑。

2、?顯影液務必覆蓋整個印跡膜。

3、?顯影液A液和B液吸取過程中必須更換移液器槍頭，避免相互污染失效。

4、?ECL工作液需避免強氧化劑如次氯酸鈉等對工作液的影響。

5、?須確保試劑瓶干凈，無微生物或其它試劑污染。為了小伙伴們的安全，請穿實驗服并佩戴一次性手套。

WB常見問題

01 高背景

原因：

①抗體濃度太高

解決辦法： 優(yōu)化/降低一抗和二抗的濃度

②抗體孵育溫度過高

解決辦法： 4℃孵育

③二抗翡特異性結合或與封閉劑交叉反應

解決辦法：設置二抗對照（不加一抗），降低二抗?jié)舛?/p>

④一抗或二抗與封閉劑有交叉反應

解決辦法：在孵育和洗滌液中加Tween-20減少交叉反應

⑤封閉不充分

解決辦法：延長封閉時間，更換適合的封閉劑（脫脂奶粉、BSA、酪蛋白）

⑥抗體與其它蛋白質(zhì)交叉反應

解決辦法：更換不同的封閉液；勿在含生物素體系中使用脫脂奶粉封閉；降低二抗?jié)舛龋粰z

測二抗與膜的交叉反應性。

⑦洗膜不充分

解決辦法：增加洗滌次數(shù)

⑧膜干燥

解決辦法：保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。

02 信號弱或無信號

原因：

①抗體

解決辦法：增加抗體濃度；抗體與抗原結合差；抗體是喪失活性

②抗原不足

解決辦法：增加上樣品

③抗原被封閉液遮蔽

解決辦法：試用不同的封閉液；優(yōu)化封閉液中蛋白質(zhì)濃度；縮短封閉時間

④蛋白質(zhì)樣品在儲存過程中降解

解決辦法：重新制備樣品

⑤轉膜不充分，或洗膜過度

解決辦法:使用麗春紅檢測轉膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉膜操作，勿過度洗膜

⑥過度封閉

解決辦法：勿過度洗膜

⑦；過度封閉

解決辦法：使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時間

⑧一抗失效

解決辦法：使用有效期內(nèi)的抗體，分裝保存，避免反復凍融取用，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用

⑨酶和底物失效

解決辦法：直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物，使用新鮮的底物

03 非特異性帶條

原因：

①一抗?jié)舛冗^高

解決辦法：在滿足一定的敏感性的情況下，降低一抗?jié)舛?/p>

②二抗引起的非特異條帶

解決辦法：免疫球蛋白是一個超家族，而標本中含有大量的類似球蛋白的抗體，容易和二抗引起反應，尤其是砸變性的情況下，在滿足敏感性要求的前提下，熒光標記一抗，酶標兔抗熒光就可以解決這個問題

③蛋白的降解

解決辦法：同上【2—（4）】

④上樣量過高

解決辦法：適當減少上樣量

⑤洗滌不完全

解決辦法：可適當延長洗滌時間

⑥封閉不好

解決辦法：延長封閉的時間；選擇更適合的封閉液

04 彌散型條帶

原因：

①抗體濃度太高

解決辦法：降低抗體濃度

②蛋白質(zhì)上樣量太多

解決辦法:降低蛋白質(zhì)上樣量

③遷移過快、電泳溫度過高

解決辦法：降低電泳速度，低溫電泳（冷室）