骨肉瘤（OS）是常見的惡性骨腫瘤，特別是在兒童和青少年中，其特點是具有侵襲性以及預(yù)后不佳，約20%的患者在第一次就診OS時由于惡性生物學(xué)行為而出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。目前，OS發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制尚不清晰，尋找新的轉(zhuǎn)移因子并確定其在骨肉瘤中的潛在機制是很有必要的。

環(huán)狀RNA（circRNAs）是一種新型的調(diào)控RNA，具有高度進(jìn)化保守性和穩(wěn)定性。circRNA可發(fā)揮miRNA海綿/RBP互作/翻譯/轉(zhuǎn)錄調(diào)控等作用，有望成為各種惡性腫瘤的潛在診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。針對于OS，目前已有報道，circTADA2A可通過發(fā)揮miR-203a-3p海綿作用來增加惡性O(shè)S行為，但是circRNAs在OS中的調(diào)控功能和潛在機制研究仍然任重而道遠(yuǎn)[1]。

2022年8月29日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科王勇醫(yī)師在Experimental and Molecular Medicine發(fā)表文章Circular RNA ROCK1, a novel circRNA, suppresses osteosarcoma proliferation and migration via altering the miR-532-5p/PTEN axis。結(jié)果顯示：OS中circROCK1-E3/E4的表達(dá)受到QKI（RNA結(jié)合蛋白）調(diào)節(jié)，并起到抑制腫瘤生長的作用。機制上，過表達(dá)circROCK1-E3/E4可發(fā)揮miR-532-5p海綿作用上調(diào)PTEN（一種抑癌基因）來抑制OS細(xì)胞增殖和遷移。并且裸鼠模型中，過表達(dá)circROCK1-E3/E4抑制腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。本研究證明了circROCK1-E3/E4在OS進(jìn)展中的功能和分子機制，諸多發(fā)現(xiàn)可作為OS分子治療的新靶點。

一、circROCK1-E3/E4可作為OS診斷的生物標(biāo)志物

前人已經(jīng)證實ROCK1基因在OS進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用[2]。因circRNA具有比線性RNA更穩(wěn)定的特性，作者將目光聚焦到可能來自ROCK1基因的潛在circRNA，經(jīng)過circBase篩選，又在OS組織和旁組織中進(jìn)行進(jìn)一步檢測，circROCK1-E3/E4（hsa_circ_0108024）脫穎而出。通過背靠背引物設(shè)計/poly尾巴檢測/ RNase R和放線菌素D/FISH定位檢測到circROCK1-E3/E4的成環(huán)/特點/穩(wěn)定性/細(xì)胞定位。在OS細(xì)胞和組織水平上，circROCK1-E3/E4顯著下調(diào)，根據(jù)此結(jié)果附加ROC曲線分析信息，提示circROCK1-E3/E4可能是診斷OS的生物標(biāo)志物。

二、QKI調(diào)控CircROCK1-E3/E4生成

QKI是一種眾所周知的RNA結(jié)合蛋白，可促進(jìn)circRNA形成。那么，QKI是否調(diào)控了circROCK1-E3/E4的生物發(fā)生呢？作者敲除QKI發(fā)現(xiàn)抑制了circROCK1-E3/ E4表達(dá)，但沒有抑制ROCK1 mRNA表達(dá)。RIP結(jié)果顯示，與β-actin相比，circROCK1-E3/ E4內(nèi)含子2和內(nèi)含子4的部分序列大量富集于QKI蛋白中。綜上提示，QKI與circROCK1-E3/ E4生成密切相關(guān)。

三、circROCK1-E3/E4調(diào)控OS細(xì)胞功能

作者設(shè)計過表達(dá)和敲低circROCK1-E3/ E4，并在HOS和U2OS細(xì)胞上加以驗證后發(fā)現(xiàn)，下調(diào)circROCK1-E3/ E4可促進(jìn)OS細(xì)胞的增殖，反之則抑制增殖；EdU染色結(jié)果與此一致。此外，下調(diào)circROCK1-E3/E4促進(jìn)OS細(xì)胞遷移，過表達(dá)則抑制遷移。提示circROCK1-E3/ E4對OS細(xì)胞的反向作用。

四、circROCK1-E3/E4機制探索-分子海綿功能

作者用RIP檢測circROCK1-E3/E4處理的細(xì)胞，使用AGO2作為陽性對照和cANRIL作為陰性對照，發(fā)現(xiàn)存在大量的circROCK1-E3/E4富集在AGO2組，提示circROCK1-E3/E4可能發(fā)揮分子海綿的作用。隨后，又經(jīng)過circBank、miRDB和TargetScan預(yù)測可能與circROCK1-E3/E4相互作用的潛在miRNAs，miR-532-5p被選中并進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過定量分析發(fā)現(xiàn)，miR-532-5p在OS存在高表達(dá)。隨后FISH檢測circROCK1-E3/E4與miR-532-5p共定位于細(xì)胞質(zhì)中；雙熒光素酶證實了二者之間存在結(jié)合。不過奇怪的是，Spearman相關(guān)分析顯示，circROCK1-E3/E4表達(dá)量與miR-532-5p呈負(fù)相關(guān)；但是敲低circROCK1-E3/E4對miR-532-5p無影響，并且miR-532-5p也不影響circROCK1-E3-E4的表達(dá)。

五、海綿機制下游探索-靶基因效應(yīng)

PTEN作為一種眾所周知的腫瘤抑制因子，廣泛參與了ncrna介導(dǎo)的多種惡性腫瘤的癌癥進(jìn)展。作者發(fā)現(xiàn)，miR-532-5p的上調(diào)和下調(diào)會反向調(diào)控PTEN的表達(dá)。在細(xì)胞功能上，miR-532-5p的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞增殖。但是協(xié)同上調(diào)PTEN，促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)，反之則結(jié)果相反；并且雙熒光素酶實驗證實了miR-532-5p通過結(jié)合PTEN 3‘UTR靶向PTEN（圖5i）。這提示，miR-532-5p在OS細(xì)胞中通過靶向PTEN作用來調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移。

作者證實circROCK1-E3/E4在蛋白水平上正向調(diào)控PTEN的表達(dá)，而miR-532-5p加入則可逆轉(zhuǎn)這一作用。在細(xì)胞功能上，miR-532-5p也能夠逆轉(zhuǎn)circROCK1-E3/E4對細(xì)胞增殖/遷移/侵襲的作用。綜上所述，circROCK1-E3/E4至少部分通過調(diào)控miR-532-5p/PTEN軸促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移/侵襲。

六、原位異種移植小鼠模型驗證

作者引入了原位異種移植小鼠模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circROCK1-E3/E4顯著抑制了OS腫瘤的生長，并且PTEN mRNA表達(dá)上調(diào)，而miR-532-5p的表達(dá)變化并不顯著。進(jìn)一步的WB和IHC實驗表明，過表達(dá)circROCK1-E3/E4促進(jìn)PTEN蛋白的表達(dá)。小鼠OS的肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，過表達(dá)circROCK1-E3/ E4雖然不能夠改變miR-532-5p表達(dá)，但是能夠抑制肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的形成。至此，體外實驗和體內(nèi)實驗均證實，circROCK1-E3/E4靶向miR-532-5p/PTEN軸可調(diào)控OS的生成。

總結(jié)

作者首次在研究中發(fā)現(xiàn)，circROCK1/E3E4受QKI調(diào)控，可靶向OS中的miR-532-5p/PTEN軸來調(diào)控OS細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步探索OS中circRNA的功能、診斷和治療方案奠定基礎(chǔ)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s12276-022-00806-z

參考文獻(xiàn)：

[1]?Wu, Y. et al. Circular RNA circTADA2A promotes osteosarcoma progression and metastasis by sponging miR-203a-3p and regulating CREB3 expression. Mol. Cancer 18, 73 (2019).

[2]?Wang, Y., Zhao, W. & Fu, Q. miR-335 suppresses migration and invasion by targeting ROCK1 in osteosarcoma cells. Mol. Cell. Biochem. 384, 105–111 (2013).

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