寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)在2019年2月12日發(fā)表于PNAS（IF：9.499，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是SusanJ. Baserga教授，研究表明除了DNA修復(fù)功能，FANCI也在核糖體的生物合成中發(fā)揮作用。

研究背景

????????Fanconi貧血（FA）是一種DNA修復(fù)疾病，其特征是骨髓衰竭和去除DNA鏈間交聯(lián)的能力降低?；加?/span>FA的個(gè)體通常在兒童早期就出現(xiàn)再生障礙性貧血和先天性異常，包括骨骼、心臟和腎臟缺陷。已知有22種蛋白質(zhì)可以通過(guò)修復(fù)DNA鏈間交聯(lián)而促進(jìn)基因組穩(wěn)定性，FA通路中的一種此類(lèi)蛋白是FANCI，其在1％FA患者中發(fā)生了突變。

????????FANCI及FANCD2一起被稱為ID復(fù)合物，其通過(guò)磷酸化和單泛素化而被激活以進(jìn)行DNA修復(fù)。另外，去泛素化酶USP1介導(dǎo)ID復(fù)合物的去泛素化對(duì)于DNA修復(fù)也很重要。盡管FANCI和FANCD2在DNA修復(fù)中以1：1的化學(xué)計(jì)量比起作用，但FANCI比FANCD2的蛋白水平更高，這引出了一個(gè)有趣的問(wèn)題，多余的FANCI的功能是什么？

????????真核生物制造核糖體的過(guò)程，被稱為核糖體生物發(fā)生（生物合成），起始于核仁（NO）。除FA外，骨髓功能障礙也是多種核糖體相關(guān)疾病的征兆。例如Diamond–Blackfan貧血（DBA）是一種遺傳性骨髓衰竭綜合征，與大小亞型核糖體蛋白的突變有關(guān)。BRCA1（FANCS）最近被證明與RNA聚合酶I（RNAPI）相互作用并調(diào)節(jié)RNAPI（該酶負(fù)責(zé)pre-rRNA的轉(zhuǎn)錄）。這些研究表明FA與核糖體生物發(fā)生缺陷之間可能存在聯(lián)系。

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摘要部分

????????本研究發(fā)現(xiàn)，除了DNA修復(fù)，FANCI在核糖體生物發(fā)生（核糖體的合成）中也起作用。作者表明，FANCI定位于核仁，在功能和物理上與前核糖體RNA（pre-rRNA）的轉(zhuǎn)錄以及大核糖體亞基（LSU）pre-rRNA的加工相聯(lián)系，且這一過(guò)程是獨(dú)立于FANCD2的。已知FANCI在被激活進(jìn)行DNA修復(fù)時(shí)是單泛素化的，但作者發(fā)現(xiàn)它在核仁中主要處于去泛素化狀態(tài)，這需要核質(zhì)USP1和核仁USP36介導(dǎo)去泛素化。作者的模型表明FA可能存在雙重病理生理機(jī)制，包括DNA修復(fù)缺陷和核糖體生物發(fā)生缺陷。

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研究?jī)?nèi)容

1.FANCI是一種核質(zhì)和核仁蛋白? ? ?

????????作者從HeLa細(xì)胞核提取物中免疫親和純化FANCI，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定共純化蛋白。令人驚訝的是，一些肽數(shù)最高的蛋白質(zhì)是核仁蛋白，包括RNA解旋酶和PeBoW復(fù)合物的所有成員，這是LSU成熟所需的復(fù)合物。通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)，作者確認(rèn)了PeBoW復(fù)合物成員PES1和BOP1與FANCI發(fā)生免疫共沉淀。這些表明，F(xiàn)ANCI與核糖體生物發(fā)生所需蛋白質(zhì)有所關(guān)聯(lián)，因此作者假設(shè)FANCI具有核仁功能。? ? ??

????????一系列高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的證據(jù)表明，F(xiàn)ANCI在核仁（NO）中起作用。FANCI被列在HeLa和T細(xì)胞的核仁蛋白質(zhì)組中，這是兩種不同的人類(lèi)細(xì)胞。FANCI是兩個(gè)核仁蛋白質(zhì)組中唯一的FA蛋白。此外還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCI與已知的人核仁DUB USP36共聚。? ? ?

????????為了檢測(cè)FANCI對(duì)NO的定位程度，作者通過(guò)成熟的亞細(xì)胞分離技術(shù)從HeLa細(xì)胞中分離核質(zhì)（NP）和NO。不同對(duì)照組的分析表明，作者分離出的NO純度很高。亞細(xì)胞分離表明FANCI和FANCD2定位于NP和NO。然后作者使用ImageJ定量FANCI和FANCD2的富集。結(jié)果表明，相對(duì)于NP，F(xiàn)ANCI在NO組分中顯著富集，而FANCD2在NP和NO中的富集沒(méi)有顯著差異。另外，在NO中，F(xiàn)ANCI相對(duì)于FANCD2的信號(hào)明顯更強(qiáng)，這表明FANCI在NO中有獨(dú)立于FANCD2的作用。? ? ?

????????作者對(duì)FANCI相關(guān)的核仁蛋白PES1進(jìn)行免疫沉淀，然后通過(guò)WB來(lái)確認(rèn)FANCI與核仁蛋白的聯(lián)系，從而確定FANCI定位于NO。實(shí)驗(yàn)顯示，在RNA降解條件下，PES1免疫共沉淀FANCI，但FANCD2沒(méi)有得到同樣程度的富集，進(jìn)一步支持了FANCI在NO中具有獨(dú)立于FANCD2的作用。此外，由于核酸的降解并沒(méi)有消除FANCI與PES1的相互作用，因此作者認(rèn)為這種相互作用不需要大的核酸。

????????作者還通過(guò)免疫熒光法對(duì)FANCI和常用的核仁標(biāo)記蛋白原纖維蛋白（fibrillarin）進(jìn)行染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，fibrillarin染色在NO的致密纖維中心，而且與FANCI共定位。FANCI和fibrillarin共定位的Pearson相關(guān)系數(shù)在0.47至0.53之間，表明這兩種蛋白之間存在適度的正線性關(guān)系。

?研究結(jié)論：除了核質(zhì)（NP），F(xiàn)ANCI在人類(lèi)細(xì)胞中更多地定位于核仁（NO）。FANCI可能具有獨(dú)立于FANCD2的核仁功能。

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2.FANCI在功能和物理上都與Pre-rRNA的轉(zhuǎn)錄有關(guān)? ? ?

????????為驗(yàn)證FANCI在核糖體生物發(fā)生中起作用的假說(shuō)，作者探究了rDNA轉(zhuǎn)錄為pre-rRNA是否需要FANCI。作者利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)測(cè)定RNAPI介導(dǎo)的rRNA轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，用一組siRNA或兩個(gè)獨(dú)立的siRNA敲低FANCI會(huì)降低rDNA轉(zhuǎn)錄，然而FANCD2的缺失并不影響rDNA的轉(zhuǎn)錄。作者還通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)初級(jí)pre-rRNA的轉(zhuǎn)錄本水平。與熒光素酶測(cè)定結(jié)果一致，F(xiàn)ANCI的缺失降低了初級(jí)pre-rRNA的水平，而FANCD2的缺失并未顯著改變其水平。因此作者得出結(jié)論，F(xiàn)ANCI在促進(jìn)rDNA轉(zhuǎn)錄中具有獨(dú)立于FANCD2的作用。? ? ?

????????發(fā)現(xiàn)FANCI和RNAPI轉(zhuǎn)錄之間有功能上的關(guān)聯(lián)后，作者進(jìn)一步探究了FANCI是否與RNAPI在物理上相關(guān)。IP實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)ANCI可與RNAPI大亞基（RPA194）發(fā)生免疫共沉淀。雙向免疫共沉淀也表明FANCI與RPA194有物理相互作用，而且這種相互作用在HEK293FT、RKO和SH-SY5Y細(xì)胞系中是保守的。因此，F(xiàn)ANCI通過(guò)促進(jìn)rDNA轉(zhuǎn)錄與RNAPI相聯(lián)系，從而在NO的核糖體生物發(fā)生中直接發(fā)揮作用。

????????作者還通過(guò)免疫熒光法探究FANCI是否與RPA194共定位。作者觀察到了同時(shí)包含F(xiàn)ANCI和RPA194的獨(dú)特斑點(diǎn)信號(hào)。另外，F(xiàn)ANCI和RPA194共定位的Pearson相關(guān)系數(shù)在0.46到0.74之間，表明這兩種蛋白之間具有中等到強(qiáng)的正線性關(guān)系，且FANCI定位于核仁。這些結(jié)果與FANCI在pre-rRNA轉(zhuǎn)錄中的功能一致，其通過(guò)與RPA194物理結(jié)合定位在NO的原纖維中心。

?研究結(jié)論：FANCI在物理和功能上與RNAPI相聯(lián)系，其可以促進(jìn)rDNA的轉(zhuǎn)錄，從而在NO的核糖體生物發(fā)生中直接起作用。

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3.FANCI是LSU生物發(fā)生和系統(tǒng)翻譯所必需的? ? ?

????????鑒于FANCI與PES1（LSU生物發(fā)生所需的一個(gè)因子）在物理上相互作用，作者探究了LSU的pre-rRNA加工是否需要FANCI。LSU的pre-rRNAs包括41S、32S和12S pre-rRNA。實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)ANCI的敲低導(dǎo)致12S pre-rRNA水平顯著下降。FANCI缺失的RAMP顯示，12S/32S、12S/41S和12S/PTP比值均顯著降低。此外，敲低PES1后，這些比值也降低了，且降低程度更大。這表明PES1和FANCI除了物理上相互作用外，在功能上也有聯(lián)系。與FANCI和PES1不同，NOL11是SSU生物發(fā)生過(guò)程中的因子，其敲低并沒(méi)有降低12S/32S、12S/41S和12S/PTP的比值。

????????通過(guò)生物分析儀檢測(cè)可知，F(xiàn)ANCI的敲低導(dǎo)致成熟的28S/18S rRNA比值顯著降低。而28S/18S rRNA比值的降低表明LSU的rRNA相對(duì)于SSU更少。因此，F(xiàn)ANCI是LSU pre-rRNA加工和維持LSU rRNA水平所必需的，這一功能可能是通過(guò)與PES1在核糖體生物發(fā)生中的直接作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

????????由于FANCI在pre-rRNA轉(zhuǎn)錄和加工過(guò)程中是必需的，作者探究了核糖體的系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成是否也需要FANCI。這個(gè)問(wèn)題特別重要，因?yàn)槎喾N其他骨髓衰竭綜合征都導(dǎo)致核糖體功能缺陷，包括DBA、Shwachman-Diamond綜合征和DC。作者使用了一種用嘌呤霉素標(biāo)記活細(xì)胞中新生多肽的系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCI的敲低會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成顯著下降。而RPS19（在DBA中突變）、DKC1（在DC中突變）和SBDS（在Shwachman-Diamond綜合征中突變）的敲低也顯著降低了蛋白質(zhì)合成水平。研究表明，與其他骨髓衰竭基因一樣，F(xiàn)ANCI是維持系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成水平所必需的。因此，F(xiàn)ANCI的缺失引起pre-rRNA轉(zhuǎn)錄和加工缺陷，也導(dǎo)致了核糖體合成蛋白質(zhì)的最終功能缺陷。

研究結(jié)論：FANCI的缺失會(huì)抑制LSU的pre-rRNA轉(zhuǎn)錄和加工，也導(dǎo)致細(xì)胞中系統(tǒng)蛋白翻譯水平的下降。因此，F(xiàn)ANCI在NO中的定位和功能對(duì)于核糖體生物發(fā)生十分關(guān)鍵，甚至延伸到細(xì)胞質(zhì)的核糖體功能。

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4.FANCI在核仁中主要處于去泛素化狀態(tài)? ? ?

????????已知FANCI和FANCD2通過(guò)單泛素化在DNA修復(fù)中被激活。WB實(shí)驗(yàn)顯示，與核質(zhì)FANCI相比，更高比例的核仁FANCI處于去泛素化形式。接著作者通過(guò)HeLa的亞細(xì)胞分離對(duì)FANCIub/FANCI的信號(hào)進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，與全細(xì)胞或核質(zhì)FANCI相比，NO中去泛素化FANCI的比例更高。另外，NO中的FANCD2ub/FANCD2與NP相比沒(méi)有顯著差異。故作者得出結(jié)論，正常生長(zhǎng)條件下，F(xiàn)ANCI在核仁中傾向于保持在去泛素化狀態(tài)。? ? ?

????????為進(jìn)一步驗(yàn)證FANCI在NO中優(yōu)先處于去泛素化狀態(tài)，作者誘導(dǎo)了FANCI和FANCD2的單泛素化。結(jié)果顯示核仁中FANCI仍主要處于去泛素化狀態(tài)，而核仁中的FANCD2并非如此。因此，在誘導(dǎo)單泛素化的條件下，F(xiàn)ANCI在NO中仍主要以去泛素化狀態(tài)存在，而FANCD2不是。

????????此外，作者探究了FANCI是否需要單泛素化才能與核仁蛋白結(jié)合。作者在表達(dá)HA標(biāo)記的FANCI的細(xì)胞中免疫沉淀RPA194，該FANCI具有抑制其單泛素化的K523R錯(cuò)義突變，作者觀察到FANCI不需要單泛素化就可以與RNAPI結(jié)合。另外，進(jìn)一步的研究顯示，單泛素化和去泛素化的FANCI均與PES1免疫共沉淀，這表明FANCI的單泛素化并不能阻止其與核仁蛋白的結(jié)合。

研究結(jié)論：在核質(zhì)中進(jìn)行DNA修復(fù)時(shí)，F(xiàn)ANCI主要處于單泛素化狀態(tài)，而核仁中的FANCI主要處于去泛素化狀態(tài)。

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5.FANCI在NP和NO間的分布隨DNA損傷而變化

????????由于正常情況下的FANCI傾向于在NO中富集，于是作者探究了DNA損傷是否改變FANCI和FANCD2在NO和NP中的比例。作者用HU或MMC處理細(xì)胞，然后對(duì)FANCI或FANCD2在核質(zhì)與核仁中的比例進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，HU處理后的FANCI或FANCD2在NP與NO中的信號(hào)無(wú)明顯差異。分析表明抑制DNA合成會(huì)降低FANCI在核仁中的富集程度。另外，MMC處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致FANCI和FANCD2在NP的信號(hào)明顯強(qiáng)于NO信號(hào)，這表明鏈間交聯(lián)的形成導(dǎo)致FANCI和FANCD2在NP和NO之間的不同定位。然而，不管是HU還是MMC處理，核質(zhì)或核仁的FANCI與FANCD2信號(hào)之間都沒(méi)有顯著差異。這與FANCI和FANCD2在DNA修復(fù)中以1：1化學(xué)計(jì)量比起作用的理論一致。

研究結(jié)論：DNA損傷阻礙了FANCI在核仁中的富集，可能會(huì)使FANCI在NP中重新分布，從而發(fā)揮其在DNA修復(fù)中的作用。

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6.FANCI在NO中去泛素化狀態(tài)的維持需要USP1和USP36? ? ?

????????由于FANCI在NO中主要維持在去泛素化狀態(tài)，因此作者探究了DUBs USP1和USP36的缺失是否會(huì)導(dǎo)致核仁中FANCIub/FANCI比值的增加。先前的研究證明USP1是FANCI和FANCD2去泛素化所必需的，并且USP36與FANCI之間有相互作用。已知USP1是一種核質(zhì)蛋白，而USP36是一種核仁蛋白，則每個(gè)蛋白可以在各自的區(qū)室調(diào)節(jié)FANCI的泛素化。WB結(jié)果表明，USP1和USP36都在物理上與FANCI結(jié)合。因此，作者確認(rèn)FANCI與USP1和USP36都有關(guān)聯(lián)。

????????接下來(lái)作者進(jìn)一步探究USP1和USP36是否調(diào)節(jié)FANCI在NO中的泛素化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在WCE中，USP1的敲低升高了FANCIub/FANCI的比值，而敲低USP36沒(méi)有造成FANCIub與FANCI的顯著差異。此外，在代表核仁的RPA194免疫沉淀物中，USP1的敲低也增加了FANCIub/FANCI的比值。因此，定位于NP和NO的FANCI均需要USP1介導(dǎo)去泛素化。有趣的是，USP36的敲低也導(dǎo)致核仁的FANCIub/FANCI比值增加約兩倍。由此可知，與USP1不同，USP36僅在NO中維持FANCI的去泛素化形式。

?研究結(jié)論：去泛素化酶USP1和USP36共同工作才能將核仁中的FANCI維持在去泛素化狀態(tài)。

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結(jié)論與討論

????????作者證明了FANCI是核糖體生物發(fā)生所需的核仁蛋白。研究表明FANCI直接在核糖體生物發(fā)生中起作用。不同于參與DNA修復(fù)的FANCI，核仁FANCI需要USP1和USP36維持其在核仁中去泛素化的狀態(tài)。另外，作者認(rèn)為FANCI在不需要DNA修復(fù)的細(xì)胞中承擔(dān)細(xì)胞代謝的作用。總之，作者的研究結(jié)果擴(kuò)展了FANCI的功能，包括核糖體生物發(fā)生和DNA修復(fù)，還強(qiáng)調(diào)了未來(lái)研究其他FA蛋白在合成核糖體中作用的重要性。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1811557116

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