舉個例子，當(dāng)老師送的植物樣本，一個基因（gene1）可能在分生組織中上調(diào)了，在保護(hù)組織中下調(diào)了，但是bulk RNA 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有區(qū)別，這樣的沒有區(qū)別其實(shí)是個假陰性，老師可以通過單細(xì)胞測序找出這種區(qū)別，進(jìn)行更為深入的研究。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）技術(shù)提供了在單細(xì)胞水平上觀測基因表達(dá)的方法，這樣可以更好地研究這些組織中不同的細(xì)胞類型。

那么我們?yōu)槭裁匆谥参镏凶?strong>單細(xì)胞測序呢？我們可以看大這里展示的擬南芥以及水稻的根組織，他們所包含的細(xì)胞類型是有一個很大的異質(zhì)性的，而同樣擬南芥中，根組織和葉片組織細(xì)胞類型也是不同的，同一組織不同細(xì)胞類型間同樣具有不同的基因表達(dá)模式，這些異質(zhì)性我們是可以借助單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)行深入研究的。

植物中單細(xì)胞測序?qū)嶋H應(yīng)用

隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的突破，單細(xì)胞測序的時代已然到來。其技術(shù)已經(jīng)大量發(fā)表在CELL、Nature、Science等高質(zhì)量期刊中，其中大多數(shù)集中在人和動物方面。近年來，單細(xì)胞測序在植物方向上的應(yīng)用也在逐步擴(kuò)大，涉及的物種包括擬南芥、水稻，以及玉米，本文就帶大家一起看一下由歐易生物助力發(fā)表的植物相關(guān)單細(xì)胞測序文章。

首先是河南大學(xué)孫旭武教授課題組在 Molecular Plant 雜志發(fā)表的一篇研究擬南芥氣孔譜系細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程的文章。

Molecular Plant ( IF 21.949 ) ；

Pub Date : 2020-06-24；

材料：5 日齡擬南芥幼苗子葉中分離的原生質(zhì)體；

技術(shù)：?10×Genomics scRNA-seq、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

這篇文章思路首先是一個常規(guī)的細(xì)胞類型的鑒定，通過文獻(xiàn)調(diào)研作者最終定義了9種細(xì)胞類型，以及另外兩種不能使用已知的標(biāo)記基因來確定的細(xì)胞類型。熱圖和小提琴圖分別對top10的基因進(jìn)行展示。

由于植物marker基因鑒定尚不成熟，所以作者為了驗(yàn)證top10 marker基因的可靠性，采取了以下2種驗(yàn)證，第一種方法通過研究top10的分子功能來推測細(xì)胞功能。作者構(gòu)建了bag6和bzip6的突變株，發(fā)現(xiàn)bag6突變株表面氣孔指數(shù)增加，推測BAG6參與調(diào)控氣孔的發(fā)育，進(jìn)而推測Cluster 9是一群參與調(diào)控氣孔的發(fā)育的細(xì)胞。

以下是第二種驗(yàn)證top10 marker基因的可靠性的方法:

2015年，Adrian那篇文章是用流式把擬南芥子葉分成了幾類細(xì)胞，然后回收這些細(xì)胞去做測序，公布了測序數(shù)據(jù)集給大家用。這篇文章就是把Figure2A中top 10基因挑出來，看看這些基因在人家的哪個細(xì)胞類型的數(shù)據(jù)集中表達(dá)了。簡單來說是把Figure2A中top10的marker基因，映射到這兩篇文章中，看看這些基因在這兩篇文章中是不是也在同一個細(xì)胞類型在表達(dá)。

世上本無marker基因，top10基因用的人多了，也就變成了marker基因。舉個例子，PC（扁平表皮細(xì)胞）他沒有特定的標(biāo)志基因，這篇文章他把鑒定到的PC高表達(dá)基因和人家數(shù)據(jù)集比對，比對到了40%，也進(jìn)一步可以說明細(xì)胞類型鑒定的可靠程度。

既然作者都用這么多方法證明了細(xì)胞類型鑒定的可靠性了，那么就可以放心開展接下來的研究了。為了發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)氣孔譜系細(xì)胞早期發(fā)育的潛在TF，作者統(tǒng)計(jì)了在不同細(xì)胞類型中顯示高表達(dá)的TFs。unknown (u.k.)_1 中 TFs數(shù)量最多，MPC_5中TFs數(shù)量最少。不知道大家記不記得，通過文獻(xiàn)調(diào)研作者最終定義了9種細(xì)胞類型，以及另外兩種不能使用已知的標(biāo)記基因來確定的細(xì)胞類型。

Cluster 9這群不為人知的細(xì)胞前面作者已經(jīng)推斷好了，他是參與調(diào)控氣孔的發(fā)育的細(xì)胞。這里發(fā)現(xiàn)Cluster 1是一群參與氣孔早期發(fā)育的基因。那話不多說我們接著看下去。

MMC，LM，EM和GMC均是氣孔的發(fā)育早期的重要細(xì)胞。因此作者著重研究MMC，LM，EM和GMC四種細(xì)胞共表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。分析結(jié)果表明ATML1, BPC1, BPC6, SCRM, PIF5,and WRKY33 可能是調(diào)控MMCs、EMs、LMs和GMCs中靶基因的表達(dá)的核心轉(zhuǎn)錄因子。

通過文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)BPC蛋白和WRKY33是參與調(diào)節(jié)幼苗生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)的重要TFs。而BPC1，BPC2，BPC4，BPC6和WRKY33的表達(dá)在MMC，LM，EM和GMC中表達(dá)也相對很高。

綜合這些因素，于是作者又研究了BPC蛋白、WRKY33和這次鑒定到的共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和已知關(guān)于這四種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPC1和BPC6可能通過這些相互作用調(diào)控早期氣孔譜系細(xì)胞的發(fā)育。

為了研究已鑒定的TFs對氣孔譜系細(xì)胞發(fā)育的影響，作者分析了它們的表達(dá)特征圖。發(fā)現(xiàn)BPC1、BPC2、BPC4和BPC6的表達(dá)主要在MMCs、EMs和GMCs中增強(qiáng)，而WRKY33在所有細(xì)胞類型中均可檢測到表達(dá)。于是作者構(gòu)建了WRKY33突變株，發(fā)現(xiàn)WRKY33突變株的M 和 GMC 細(xì)胞比例上升，但 GC 細(xì)胞比例下降，表明 BPCs 蛋白可能參與介導(dǎo) M 到 GMC 的發(fā)育過程，從而促進(jìn)氣孔譜系早期發(fā)育。作者構(gòu)建了BPC突變株，也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。

最后為了分析氣孔分化過程中的發(fā)育軌跡，作者使用 Monocle 2 軟件對 scRNA-seq 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬時序分析，擬時序路徑共有三個分支?？傮w來看，從 MMC 到 GC 可以看到氣孔譜系細(xì)胞的不同發(fā)育過程。

這篇文章作者對擬南芥氣孔譜系細(xì)胞發(fā)育過程進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定了氣孔發(fā)育過程中各細(xì)胞類群顯著表達(dá)的 marker gene，并分析了其所參與的 GO 功能。為了分析氣孔細(xì)胞早期發(fā)育階段的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建了氣孔分生母細(xì)胞中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步通過分析所鑒定的標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥突變體的氣孔發(fā)育表型，確定了這些基因在調(diào)控氣孔發(fā)育中所扮演的重要角色。這項(xiàng)研究為利用單細(xì)胞RNA-測序技術(shù)在鑒定新的標(biāo)記基因，以及解析氣孔譜系細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了新的研究思路和技術(shù)體系。

接下來這篇文章是福建農(nóng)林大學(xué)等單位的研究人員在水稻葉片原生質(zhì)體中構(gòu)建了TF（OsNAC78）的差異表達(dá)系統(tǒng)，對構(gòu)建好的原生質(zhì)體進(jìn)行scRNA-seq。

Frontiers in Plant Science (IF 6.627)；

Pub Date : 2020-11-16；

材料：MH63水稻幼苗原生質(zhì)體；

技術(shù)：10×Genomics scRNA-seq單細(xì)胞測序

這篇文章老師重點(diǎn)是利用單細(xì)胞測序來篩選轉(zhuǎn)錄因子的一個靶基因。

老師為了研究OsNAC78這個轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，將OsNAC78過表達(dá)到MH63水稻幼苗中，對照組為野生型MH63水稻幼苗。

通過對OsNAC78高表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞亞型分析，發(fā)現(xiàn)cluster1和cluter4一個是表達(dá)OsNAC78最多的cluster一個是表達(dá)OsNAC78最少的cluster。

于是作者針對cluter1和4做了一個差異分析，將cluster4中上調(diào)的19個候選基因基因單出拎了出來。

隨后作者通過過表達(dá)OsNAC78，看看有哪些基因可以隨著OsNAC78的過表達(dá)也跟著上調(diào)。結(jié)果篩選出了兩個基因。然后我們通過文獻(xiàn)調(diào)研等手段構(gòu)建了一些Os01g0934800 和 Os01g0949900啟動子的報(bào)告質(zhì)粒，然后酵母單雜來篩OsNAC78會和哪個啟動子結(jié)合，找到啟動子后。作者又做了EMSA和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了一下Os01g0934800 和 Os01g0949900確實(shí)是OsNAC78的靶基因。

2022年2月26日，河南大學(xué)孫旭武教授團(tuán)隊(duì)在The Plant Journal 雜志發(fā)表了一篇通過對擬南芥幼苗子葉的單細(xì)胞測序，揭示了子葉葉脈的早期發(fā)育動態(tài)的文章。

The Plant Journal ( IF 7.091 )；

Pub Date : 2022-02-26；

材料：擬南芥3天齡子葉原生質(zhì)體；

技術(shù)：10×Genomics scRNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

這篇文章作者重點(diǎn)關(guān)注葉脈的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，其中涉及到一些篩選葉脈發(fā)育中被激活基因的方法（方法1：通過每組top10的基因，構(gòu)建基因突變株進(jìn)行篩選；方法2：通過研究重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建基因突變株進(jìn)行篩選）。

這篇文章思路首先是一個常規(guī)的細(xì)胞類型的鑒定，通過文獻(xiàn)調(diào)研作者最終定義了9種細(xì)胞類型，以及另外1種不能使用已知的標(biāo)記基因來確定的細(xì)胞類型。

將每個cluster間的差異表達(dá)基因去做了富集分析，也進(jìn)一步可以說明細(xì)胞類型鑒定的可靠程度。

為了篩選葉脈發(fā)育中被激活基因，作者將每個cluster中top 10的基因構(gòu)建基因的突變株，隨后進(jìn)行葉脈發(fā)育的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，紅框圈出來的基因在葉脈發(fā)育過程中被激活。

為了進(jìn)一步分析子葉葉脈的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，研究接下來分析了特定組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在 PP、CC_4 和 XP 中鑒定到的核心轉(zhuǎn)錄因子分別是CDF5、ERF15 和 RGA。通過比對別人文章的DAP-SEQ(DNA親和純化測序)，發(fā)現(xiàn)CDF5 靶基因。隨后對CDF5 靶基因進(jìn)行 GO 富集分析。通過對野生型和CDF5 突變植株葉片中CDF5下游靶基因進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)突變體中CDF5 靶基因會下調(diào)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了DAP-SEQ的結(jié)果。構(gòu)建CDF5基因突變株，葉脈發(fā)育的實(shí)驗(yàn)表明，CDF5的基因在葉脈發(fā)育過程中被激活。

最后作者為了了解葉脈分化過程中的發(fā)育軌跡，使用 Monocle 2 軟件對 scRNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序 數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬時序分析，并且通過RNA速率分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)BS、XP和CC_8簇中細(xì)胞的RNA速度發(fā)生了很大的變化，認(rèn)為這些cluster代表快速分化的細(xì)胞。與擬時分析結(jié)果一致，BS、XP和CC_8在擬時間后期富集，有可能與葉脈發(fā)育有關(guān)。同時擬時分析熱圖也展示了基因表達(dá)沿著擬時間軸的變化。

接下來是南繁種業(yè)所生物育種研究室發(fā)表的一篇玉米根尖細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文章。

The Crop Journal ( IF 4.407 )；

Pub Date : 2022-03-09；

材料：B73-玉米幼苗根原生質(zhì)體；

技術(shù)：10×Genomics scRNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

作者為了識別硝酸鹽脅迫條件下，特異性硝酸鹽反應(yīng)基因。利用含（硝酸鹽+）或不含硝酸鹽（硝酸鹽-）的培養(yǎng)液中生長的玉米根的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。

這篇文章首先還是一個細(xì)胞類型的鑒定，F(xiàn)圖是一個marker基因的展示圖，G圖他是展示了不同聚類與中柱鞘和根毛的相關(guān)性氣泡圖，發(fā)現(xiàn)cluster8與中柱鞘的相關(guān)性程度高，而cluster5與根毛相關(guān)性程度高，也是符合細(xì)胞類型鑒定的一個結(jié)果的。Fig2給每個細(xì)胞類型做了一個功能富集分析。

于是乎作者利用slingshot algorithm研究了表皮和根毛的分化軌跡?？梢钥闯龈?xì)胞是從表皮細(xì)胞分化而來的。對軌跡中100個最重要的基因根據(jù)基因表達(dá)模式進(jìn)行層次聚類，聚類后得到了兩個gene cluster。很顯然gene 2 cluster 在兩個分支上是差異相對比較大。于是乎作者對這群基因又做了一次富集分析。這些結(jié)果并反映了根表皮細(xì)胞分化過程中的轉(zhuǎn)錄重組信息，從而再現(xiàn)了根毛的發(fā)育過程。

文章的最后作者還把玉米的根和三個品系的水稻根但細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（文獻(xiàn)調(diào)研）進(jìn)行了比對，C圖 發(fā)現(xiàn)了58個核心同源基因（保守基因）在兩個物種的根毛中均有高表達(dá)，并對這些基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因參與了根毛和表皮細(xì)胞的發(fā)育。D圖玉米和水稻分離根細(xì)胞的UMAP可視化。

最后，由于植物細(xì)胞原生質(zhì)體解離的成功對植物的生長狀態(tài)有較高要求，為確保植物取樣部位新鮮，我們建議老師把生長狀態(tài)良好的活體植株直接運(yùn)輸，取材前與我們實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員溝通好具體的取材部位和注意事項(xiàng)，將由小歐繼續(xù)培育植物樣本到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

目前我們成功解離的植物樣本也是琳瑯滿目（油橄欖、土豆、石斛、茶樹、桑樹、葡萄、大蒜、大豆、水稻等）… …快要能夠開一個小小的植物園了！

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