免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一種通過與附著在可沉淀基質(zhì)（磁珠或瓊脂糖樹脂等固相支持物）上的特異性抗體結(jié)合來對抗原進行小型親和純化的方法。需要從細胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子時，免疫沉淀是最常用的方法之一。

原理：

Ⅰ 免疫沉淀由幾個階段組成：

1）細胞裂解：在存在或不存在去污劑的情況下通過裂解細胞來提取抗原。為了提高特異性，可以使用蛋白?A-瓊脂糖珠預(yù)清除細胞裂解物。

2）抗體固定：將特異性抗體與蛋白A-瓊脂糖珠結(jié)合。

3）抗原捕獲：將細胞裂解中得到的抗原與抗體固定中得到的固定化抗體一起孵育，然后除去未結(jié)合蛋白質(zhì)。

Ⅱ 免疫沉淀抗原可與抗體分離，并通過“免疫沉淀-重捕獲”重新沉淀。該方案可用同一抗體進一步純化抗原，也可用不同抗體來鑒定多亞基復(fù)合物的成分或研究蛋白-蛋白的相互作用。

1）抗原的解離和變性：用與蛋白A-瓊脂糖珠結(jié)合的抗體1免疫沉淀的抗原在SDS和DTT存在下加熱解離和變性。

2）二抗固定：抗體2與蛋白A?-瓊脂糖珠結(jié)合。

3）重捕獲：變性抗原（條紋橢圓形）被與蛋白 A -瓊脂糖珠結(jié)合的抗體2重新捕獲；或者抗體1可以再次用于進一步純化原始抗原（正方形）。

基本流程：

IP均需經(jīng)過孵育、beads收集（離心或磁性裝置）及溶液移除這三個步驟。最后一步的洗脫通常包括對用于SDS-PAGE的上樣緩沖液中的beads進行加熱，這可使蛋白質(zhì)變性及發(fā)生不可修復(fù)性損傷。

預(yù)固定抗體IP中，特定蛋白的抗體（單克隆或多克?。┕潭ㄔ诓蝗苄灾С治铮ㄈ绛傊腔虼胖椋┥希S后與含有目標(biāo)蛋白的細胞裂解物一起孵育。在孵育期間，輕輕攪動裂解物使目標(biāo)抗原結(jié)合到固定抗體上，形成抗原-抗體免疫復(fù)合物。隨后，將免疫復(fù)合物從固相支持物上洗脫，進行目標(biāo)抗原的性質(zhì)分析。游離抗體IP中，將游離的未結(jié)合抗體加入裂解物中形成免疫復(fù)合物，然后利用填料回收復(fù)合物。

雖然預(yù)固定抗體法更常用于IP，但是如果目標(biāo)蛋白濃度較低、抗體與抗原的結(jié)合親和力較弱，則使用游離抗體形成免疫復(fù)合物的方法更好。

實驗步驟：

1.?使用未標(biāo)記抗體與瓊脂糖顆粒

1.1. 一抗反應(yīng)：在離心管中加入蛋白樣品及一抗，置于旋轉(zhuǎn)混勻器上4℃反應(yīng)適宜時間。

1.2. 二抗反應(yīng)：加入結(jié)合了二抗的瓊脂糖顆粒，置于旋轉(zhuǎn)混勻器上4℃反應(yīng)適宜時間。

1.3. 洗滌：

（i）離心收集瓊脂糖顆粒，除去上清（注意不要吸出瓊脂糖顆粒）；

（ii）加入預(yù)冷的洗脫液或洗滌緩沖液，混勻后離心，除去上清（注意不要吸出瓊脂糖顆粒），重復(fù)該步驟?3~4次；

（iii）加入SDS樣品緩沖液，加熱5分鐘使目的蛋白從顆粒上分離，接著離心收集上清，收集的上清即可作為SDS-PAGE樣品使用。

1.4. WB等后續(xù)操作

2.?使用標(biāo)簽抗體結(jié)合磁珠

2.1. input 樣品制備：向細胞中加入細胞裂解液并旋轉(zhuǎn)混勻，然后離心取上清，加入His-Flag-V5-GFP制備input樣品（需另取部分作為SDS-PAGE的input樣品使用）。

2.2. 抗體反應(yīng)

（i）取Anti-V5-tag mAb-Magnetic Beads裝入離心管中并用緩沖液洗滌（注意磁珠容易沉淀，使用前需進行充分旋轉(zhuǎn)混勻）；

（ii）將適量制備好的input樣品加入磁珠（Magnetic beads）中，并在4°C下旋轉(zhuǎn)孵育適宜時間。

2.3. 洗滌：

（i）用緩沖液洗滌4次（蓋子上粘附的東西也需清洗干凈）；

（ii）加入SDS樣品緩沖液，加熱5分鐘使目的蛋白從顆粒上分離，接著用磁力架磁性分離磁珠（由于可通過磁力固定，故在洗滌過程中幾乎沒有樣品損耗）。

2.4. WB等后續(xù)操作

IP微珠選擇：

1. 瓊脂糖珠（樣品體積> 2 mL）：當(dāng)大量抗體成本較低且想要純化大量目標(biāo)蛋白用于多種下游分析時，瓊脂糖最適用于柱親和色譜或獨立大型旋轉(zhuǎn)杯免疫沉淀反應(yīng)。

2. 磁珠（樣品體積< 2 mL）：在日常小型分離特定蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物時，磁珠可實現(xiàn)結(jié)合能力/得率、可重復(fù)性、純度和成本節(jié)約之間的平衡。當(dāng)進行手動和自動化標(biāo)準IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反應(yīng)并立即用于后續(xù)檢測分析時，磁珠是最佳選擇。

參考：

[1]?Bonifacino, J.S., Gershlick, D.C., and Dell'Angelica, E.C. 2016. Immunoprecipitation. Curr. Protoc. Cell Biol. 71: 7.2.1- 7.2.24. doi: 10.1002/cpcb.3

[2] ThermoFisher科技公司-免疫沉淀(IP)技術(shù)綜述

[3] 知乎-蛋白純化--免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）

[4] 知乎-一文看懂IP實驗，完整實驗流程看這里！

[5]?Bjorck L. and Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein g, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 969-74

[6]?Harlow, Ed, and Lane, David. (1999) Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press

[7]?Wikstrom M. et al. (1995) Mapping of the immunoglobulin light chain-binding site of protein l. J Mol Biol. 250, 128-33