期刊：gut

影響因子：24.5

導(dǎo)語

慢性胰腺炎（CP）是一種可能致命的外分泌胰腺疾病，目前尚無特效或有效的治療方法。由于難以獲得胰腺組織，人們對人類CP的局部免疫反應(yīng)或發(fā)病機(jī)制知之甚少。我們試圖使用來自CP和非CP器官供體不同病因患者的組織來表征胰腺免疫反應(yīng)，以鑒定與人類CP相關(guān)的關(guān)鍵信號分子。

研究技術(shù)

我們通過對來自器官供體、遺傳性全胰腺切除術(shù)和特發(fā)性CP患者的胰腺免疫細(xì)胞進(jìn)行測序和t細(xì)胞受體（TCR）測序，對轉(zhuǎn)錄組和表位進(jìn)行單細(xì)胞水平的細(xì)胞索引。我們通過對第二例CP隊列患者進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和功能分析來驗證基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

研究路線

研究結(jié)果

1. 人胰腺免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜揭示了CP中獨(dú)特的疾病特異性特征

從捐贈者（n=3）和CP患者（遺傳n=5和特發(fā)性n=4）收集胰腺組織，分選免疫細(xì)胞，用13種不同的表面蛋白抗體進(jìn)一步染色，后進(jìn)行scRNA-seq和scTCR-seq。質(zhì)控后獲得28547個細(xì)胞，分17個cluster。鑒定出的主要免疫細(xì)胞是T細(xì)胞、髓系細(xì)胞、B細(xì)胞和肥大細(xì)胞。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，對照胰腺組織的主要免疫細(xì)胞是髓系細(xì)胞，而CP組織的胰腺免疫細(xì)胞主要是T細(xì)胞。巨噬細(xì)胞，包括cluster5、9和11，在對照組中富集；t細(xì)胞簇在CP組中擴(kuò)大，cluster2是遺傳性CP中富集的主要t細(xì)胞簇，而cluster0在特發(fā)性CP中占優(yōu)勢。對CP與對照組之間的DEGs進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果有炎癥反應(yīng)的強(qiáng)烈特征，包括細(xì)胞凋亡、缺氧、白細(xì)胞介素2-STAT5、干擾素和腫瘤壞死因子（TNF）-α信號通路?？偟膩碚f，來自對照組和CP組織的胰腺免疫細(xì)胞分析表明，局部致病組織區(qū)域存在疾病特異性免疫反應(yīng)，遺傳性和特發(fā)異性CP組之間有不同的免疫轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)特征。

2. 遺傳性和特發(fā)性CP之間的胰腺T細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄組特征

在對照組和CP患者胰腺中存在的主要免疫細(xì)胞群是T細(xì)胞。分析了T細(xì)胞亞群（cluster0、1和2)，共15 913個細(xì)胞，鑒定了13種不同的T細(xì)胞。UMAP顯示細(xì)胞簇明顯分為三組：對照組、遺傳性CP和特發(fā)性CP。對照細(xì)胞主要由GZMA+細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞組成，遺傳性CP細(xì)胞主要由CD4+ Th亞群組成，包括CCR6+、TNF+（Th1）、調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞和HLA-DA+ CD8+ T細(xì)胞。然而，F(xiàn)TH1+ CD4+和BAG3+ CD8+ T細(xì)胞是特發(fā)性CP樣本中主要的T細(xì)胞。分析了遺傳性CP與特發(fā)性CP相比，在總T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞或CD8+ T細(xì)胞中的DEGs。與特發(fā)性CP相比，其中一些基因在遺傳性基因中表達(dá)上調(diào)，它們包括趨化受體和配體，如CCR6、CXCR4、GPR183和CCL20，表明它們參與了遺傳性CP中CD4+T細(xì)胞的募集。

3. 在CP中，CD8+T細(xì)胞依賴的獨(dú)特的TCR庫變化

從對照和CP的12個樣本中，共鑒定了5180個T細(xì)胞，12 856對特異的αβ TCR序列。在對照組T細(xì)胞中，15.6%±6.0%獨(dú)特的克隆型由兩個或兩個以上的細(xì)胞共享，顯著高于遺傳性CP T細(xì)胞（4.03%±1.6%）。與此結(jié)果相對應(yīng)，對照組T細(xì)胞的Gini coefficient（克隆性指數(shù)）也顯著高于遺傳性CP組，表明在遺傳性CP的T細(xì)胞中，克隆擴(kuò)增率較低。不同T細(xì)胞簇的Gini coefficient顯示在對照和 CP組CD8+ T細(xì)胞傾斜克隆擴(kuò)增。當(dāng)把T細(xì)胞分為CD8+ T細(xì)胞和其他T細(xì)胞時，CD8+ T細(xì)胞的基尼系數(shù)明顯高于其余T細(xì)胞。通過比較CD8A基因表達(dá)的UMAPs和克隆擴(kuò)增的細(xì)胞群，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。

4. 在CP中，t細(xì)胞譜系和共享的抗原結(jié)合基序之間的獨(dú)特的相互作用

為了解T細(xì)胞簇之間的聯(lián)系和起源，通過分析所有組或每個組內(nèi)的克隆型，檢查了獨(dú)特的克隆型（匹配的單細(xì)胞TCR-αβ譜）和它們在不同cluater之間的重疊。在 CD8+ cytotoxic T-cell clusters (Tc-1 and Tc-3)之間發(fā)現(xiàn)了最大的克隆型重疊，它們有40個共享的克隆型，主要由特發(fā)性CP組驅(qū)動。有63 個獨(dú)特的克隆型在特發(fā)性CP的CD8+ cytotoxic T-cell clusters中發(fā)現(xiàn)了共享的克隆型。CCR6+ CD4+ T細(xì)胞與Th1細(xì)胞之間的克隆型重疊最高，有23個共享克隆型，這些重疊主要發(fā)生在遺傳性CP中。這些共享的TCR克隆型闡明了不同t細(xì)胞亞型之間的獨(dú)特相互作用和每個CP組的克隆動力學(xué)。

為了檢驗在對照組和CP樣本中發(fā)現(xiàn)的胰腺TCR是否識別相同的抗原，通過GLIPH2分析篩選TCR CDR3β氨基酸序列上共享的抗原結(jié)合基序來識別相同表位的集群TCR。根據(jù)最終的評分，從所有三組（對照組和兩個CP組）中選擇了至少兩個個體共享的基序，其中顯示了三個聚類，因為它們在配對的CDR3α序列中也具有一定程度的相似性。結(jié)果顯示，所選的集群主要由遺傳性和特發(fā)性CP組的個體共享，而不是對照組。值得注意的是，三個具有獨(dú)特共同基序的候選簇中的大多數(shù)tcr主要由遺傳性CP組的個體共享，這表明遺傳性CP中的T細(xì)胞更有可能對共同抗原或表位發(fā)生反應(yīng)。

5. 人胰腺髓系細(xì)胞的明顯轉(zhuǎn)錄改變

髓系細(xì)胞是在對照組和CP受試者的胰腺中發(fā)現(xiàn)的胰腺免疫亞群的另一個關(guān)鍵組成部分。進(jìn)一步對髓系的亞群（clusters 3, 4, 5, 6, 9 and 11）進(jìn)行細(xì)分，鑒定出11個不同細(xì)胞亞群，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)。并且每組細(xì)胞（對照組、遺傳性CP或特發(fā)性CP）聚集在一起，重疊最小。與CP患者比較，CD68+和CD163+巨噬細(xì)胞和S100A8+單核細(xì)胞（clusters3和8）的頻率顯著升高。遺傳性CP中CCL20+單核細(xì)胞的頻率明顯高于對照組或特發(fā)性CP樣本。CP患者與對照組的DEG分析顯示了各種炎癥和趨化分子，如IL1B、CXCL2、CXCL3、CXCL8和CCL4，這些分子在富集的CP髓系細(xì)胞中顯著上調(diào)和炎癥信號通路。遺傳性CP與特發(fā)性CP的DEG分析發(fā)現(xiàn)包括HLA-DR、CCL20和IL1B顯著上調(diào)。

6. 在遺傳性CP，CCR6-CCL20軸功能分析

與遺傳性CP的CD4+ T細(xì)胞和單核細(xì)胞群體中CCR6-CCL20軸的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)一致，通過分析總免疫細(xì)胞群的差異，比較遺傳性CP和特發(fā)性CP，證實(shí)了這種獨(dú)特的趨化因子和受體軸的參與。遺傳性CP和特發(fā)性CP相比，CCR6和CCL20是顯著上調(diào)的前20個基因之一。此外，為了評估髓系細(xì)胞和T細(xì)胞之間的串?dāng)_，通過受體配體的表達(dá)水平分析了髓系細(xì)胞和T細(xì)胞區(qū)室之間的細(xì)胞因子或趨化因子受體-配體的相互作用。CCR6-CCL20軸僅在兩組CP中表達(dá)，遺傳性CP中CCR6-CCL20的表達(dá)明顯高于特發(fā)性CP。最后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了從第二組對照組和CP患者中分離出來的T細(xì)胞中CCR6蛋白的表達(dá)。與對照組相比，遺傳性CP中CD8+ T細(xì)胞的頻率顯著降低，而CD4+ T細(xì)胞的頻率顯著升高。與scRNA-seq結(jié)果一致，特發(fā)性CP中CD8+或CD4+ T細(xì)胞的頻率介于中間，介于對照組和遺傳性CP之間。與對照組或特發(fā)性CP相比，遺傳性CP中表達(dá)CCR6的CD4+ T細(xì)胞的百分比顯著增加。遺傳性CP樣本的CD4+ T細(xì)胞中CCR6蛋白表達(dá)升高后，通過ELISA檢測了遺傳性CP中胰腺單核細(xì)胞分泌的CCL20。此外，通過免疫熒光驗證，在遺傳性CP的胰腺組織切片CCR6+和CCL20+細(xì)胞分別與CD4+和CD45+免疫細(xì)胞共定位。接下來，通過ccl20介導(dǎo)的細(xì)胞遷移實(shí)驗來評估T細(xì)胞中CCR6表達(dá)的功能意義。

進(jìn)行Transwell趨化，CXCL12作為陽性對照，來自遺傳性CP組織的胰腺免疫細(xì)胞向可溶性重組人CCL20遷移，其濃度與以前的報道相當(dāng)。胰腺浸潤性T細(xì)胞對CCL20的趨化反應(yīng)性的增加證實(shí)了遺傳性CP中受體（CCR6）表達(dá)的增加的功能意義。這些數(shù)據(jù)表明，T細(xì)胞通過CCR6-CCL20軸遷移并浸潤遺傳性CP中的病變胰腺。

參考文獻(xiàn)：

Lee Bomi,Namkoong Hong,Yang Yan et al. Single-cell sequencing unveils distinct immune microenvironments with CCR6-CCL20 crosstalk in human chronic pancreatitis.[J] .Gut, 2022, 71: 1831-1842.