寫在前面

????????今天推薦的是由美國洛克菲勒大學(xué)在2020年5月19日發(fā)表于Molecular Cell（2020IF：17.970，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Thomas Tuschl教授，研究表明G3BP1-Family-USP10去泛素化酶復(fù)合物可恢復(fù)因溶酶體降解而停滯的核糖體的泛素化40S亞基。

研究背景

????????準(zhǔn)確讀出遺傳密碼對于生產(chǎn)功能性蛋白質(zhì)至關(guān)重要。因此，在轉(zhuǎn)錄和成熟后檢測mRNA的錯誤，以及消除由突變等位基因編碼的轉(zhuǎn)錄本，是至關(guān)重要的過程。核糖體相關(guān)質(zhì)量控制 (RQC) 通過檢測與異常mRNA碰撞的核糖體和不同小核糖體亞基蛋白的單泛素化，在E3連接酶ZNF598啟動的多步分子過程中清除異常mRNA和新生多肽。

摘要部分

????????作者表明RPS2、RPS3和RPS10的去泛素化需要G3BP1家族-USP10復(fù)合物，以從程序性降解中拯救修飾的40S亞基。USP10或G3BP1家族蛋白的敲除增加了溶酶體核糖體降解并擾亂了核糖體亞基化學(xué)計量，這兩者都被RPS3的單個K214R取代所恢復(fù)。雖然大多數(shù)RPS2和RPS3單泛素化是由ZNF598依賴的核糖體碰撞感知啟動RQC引起的，但另一個次要途徑促成了它們的單泛素化。G3BP1家族蛋白長期以來一直被認(rèn)為是RNA結(jié)合蛋白，然而，作者的結(jié)果將40S亞基和相關(guān)的mRNA確定為它們的主要目標(biāo)，這是G3BP1家族蛋白在壓力下定位的應(yīng)激顆粒所共有的特征。

研究內(nèi)容

1.G3BP1-Family-USP10復(fù)合物優(yōu)先交聯(lián)成熟mRNA和18S rRNA的編碼序列??? ?

????????為了研究G3BP1-家族-USP10復(fù)合物的細(xì)胞功能，作者首先通過質(zhì)譜分析和G3BP1-或USP10表達(dá)的HEK293細(xì)胞系的免疫印跡（IB）確認(rèn)它們的穩(wěn)定相互作用。作者發(fā)現(xiàn)，在表達(dá) FH-G3BP1或 FH-G3BP2 的細(xì)胞系的光活化核糖核苷增強的交聯(lián)和免疫沉淀 (PAR-CLIP)在預(yù)期的分子質(zhì)量上產(chǎn)生了單個放射性標(biāo)記的RNA蛋白交聯(lián)帶。然而，F(xiàn)H-USP10蛋白的 PAR-CLIP 產(chǎn)生了兩個不同的放射性標(biāo)記帶，一個在 120 kDa 處對應(yīng)于 FH-USP10，另一個在 70 kDa 處被 IB 鑒定為G3BP1，可能也包含 G3BP2。對應(yīng)于 FH-USP10和共免疫沉淀G3BP1家族RBP的交聯(lián)讀數(shù)也彼此具有很好的相關(guān)性（Pearson r = 0.85）。

????????最后，作者檢測到USP10和G3BP1家族RBP與18S rRNA的交聯(lián)，但未檢測到28S rRNA。與H26的交聯(lián)顯示出不同但重疊的USP10和G3BP1蛋白的T到C轉(zhuǎn)換模式，表明 rRNA表面和USP10-G3BP1家族的N端異二聚化結(jié)構(gòu)域的空間接近性復(fù)合物結(jié)合，而不是直接與高親和力rRNA結(jié)合。

研究結(jié)論：G3BP1-Family-USP10復(fù)合物優(yōu)先交聯(lián)成熟mRNA和18S rRNA的編碼序列。

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2.G3BP1-Family-USP10復(fù)合物調(diào)節(jié)多聚核糖體譜和核糖體亞基豐度

????????親本細(xì)胞裂解物的多聚核糖體分析和IB表明多聚核糖體中存在G3BP1、G3BP2 和USP10蛋白，但也存在較小的無核糖體大小部分。為了研究G3BP1-family-USP10復(fù)合物在翻譯調(diào)節(jié)中的作用，作者首先生成了G3BP1或 G3BP2單個KO細(xì)胞。作者觀察到KO和親本細(xì)胞之間的細(xì)胞增殖沒有顯著差異。G3BP1和 G3BP2 雙KO(G3BP1/2-DKO) 細(xì)胞是有活力的，但顯示增殖率降低和普遍翻譯停滯的跡象，伴隨著多聚核糖體減少到單體和游離 60S 亞基的明顯積累。在USP10-KO 細(xì)胞中，增殖率略有降低，作者還觀察到60S亞基的明顯積累。Dox誘導(dǎo)的FH-USP10表達(dá)則回補了USP10-KO細(xì)胞中的這種表型，而催化失活的FH-C424AUSP10則沒有。

研究結(jié)論：G3BP1-Family-USP10復(fù)合物調(diào)節(jié)多聚核糖體和核糖體亞基豐度。

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3.USP10介導(dǎo)40S核糖體亞基的位點特異性去泛素化

????????USP10的酵母同源物Ubp3p是一種單泛素特異性蛋白酶，它利用Bre5形成活性酶復(fù)合物，從底物而不是多泛素鏈上切割單個泛素分子。為了鑒定G3BP1家族-USP10復(fù)合物的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，作者在USP10-KO與FHUSP10過表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行了泛素殘留免疫親和分析。作者在USP10-KO細(xì)胞中最富集的泛素化蛋白中鑒定了RPS2、RPS3和RPS10（log2FC > 5），并通過IB確認(rèn)了這些結(jié)果，沒有觀察到RPL23A （RPL23A是酵母Rpl25的人類同源物，是Ubp3p在酵母營養(yǎng)饑餓條件下的一個常用的靶標(biāo)）的泛素化。RPS2、RPS3和RPS10的單泛素化被 FH-USP10的表達(dá)回補。G3BP1/2-DKO也導(dǎo)致單泛素化RP的積累，盡管與USP10-KO 相比程度較低。親本或G3BP1/2-DKO細(xì)胞裂解物中USP10的IB顯示G3BP1/2-DKO后USP10蛋白水平顯著降低，表明USP10異源二聚化具有G3BP1蛋白的穩(wěn)定功能。與親本細(xì)胞相比，在USP10-KO 細(xì)胞的40S、80S和多聚體部分中可檢測到單泛素化RP的富集。

研究結(jié)論：USP10介導(dǎo)40S核糖體亞基的位點特異性去泛素化。

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4.G3BP1-Family-USP10復(fù)合物對40SRP的去泛素化可防止40S亞基溶酶體降解? ? ?

????????為了揭示位點特異性RP（去）泛素化的功能，作者對親本、USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 細(xì)胞裂解物進(jìn)行了基于質(zhì)譜的無標(biāo)記蛋白定量。與親本細(xì)胞相比，作者觀察到USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 細(xì)胞中40S和 60S RPs 相對于所有其他蛋白質(zhì)的特異性減少。與親本細(xì)胞相比，USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 細(xì)胞中 18S rRNA與 28S rRNA的UV260吸光度比證實了蛋白質(zhì)組學(xué)差異。為了確定哪種蛋白質(zhì)和位置特異性單泛素化負(fù)責(zé)40S亞基的降解，作者首先通過過度表達(dá)C端Myc標(biāo)記的野生型、K214R、K227R、K230R 或 K227R/K230R 突變RPS3來取代內(nèi)源性RPS3。IB證實了Myc標(biāo)記的野生型和突變型RPS3對內(nèi)源性RPS3的化學(xué)計量替代。重要的是，通過表達(dá)K214R-RPS3來阻斷RPS3的泛素化，回補了USP10-KO 以及G3BP1/2-DKO 細(xì)胞中核糖體亞基的失衡。另一方面，K214R-RPS3的單獨表達(dá)消除了內(nèi)源性RPS2的泛素化。

????????為了進(jìn)一步研究核糖體亞基降解的機(jī)制，作者用 pH 敏感的熒光Keima蛋白標(biāo)記RPS3、K214R-RPS3和 RPL28，以量化酸性溶酶體的重定位。在親本或USP10-KO 細(xì)胞中表達(dá)的Keima嵌合體用Torin1處理導(dǎo)致561/445 nm熒光強度比增加，也稱為自噬通量。有趣的是，在沒有 Torin1、RPS3-Keima 而不是突變體K214R-RPS3-Keima 的情況下，與親本細(xì)胞相比，USP10-KO中的自噬通量增加，表明K214處的RPS3泛素化對溶酶體降解至關(guān)重要。此外，與RPS3-Keima 相比，RPL28-Keima的自噬通量總體上變化不太明顯，這與RPS3泛素化后40S亞基降解的驅(qū)動作用一致。

研究結(jié)論：G3BP1-Family-USP10復(fù)合物對40SRP的去泛素化可防止40S亞基溶酶體降解。

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5.USP10或G3BP1系列RBP不會損害功能RQC

????????ZNF598是異常mRNA碰撞核糖體的傳感器，通過位點特異性泛素化RPS10和RPS20 觸發(fā)RQC，而一些研究還指出RPS3的ZNF598依賴性泛素化。為了評估G3BP1家族-USP10復(fù)合物在感知異常mRNA中的潛在作用，作者生成了穩(wěn)定表達(dá)GFP和 mCherry (mCh) 融合蛋白的報告細(xì)胞系。正如預(yù)期的那樣，與親本細(xì)胞相比，KO細(xì)胞系在由對照 (ACTAGC)6間隔區(qū)連接的熒光融合蛋白的表達(dá)中沒有受到干擾。然而，與親本、USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 細(xì)胞中的 (ACTAGC)6 間隔區(qū)相比，由 (AAA)12 間隔區(qū)連接的融合蛋白的表達(dá)降低了10倍，表明RQC處于活躍狀態(tài)并且USP10或G3BP1家族RBP在其啟動階段。相比之下，無論間隔序列如何，ZNF598-KO 細(xì)胞中的熒光融合蛋白表達(dá)都沒有改變，因為這些細(xì)胞無法感知異常mRNA。RPS10的K138R突變部分重現(xiàn)了這種效果，防止核糖體碰撞時依賴ZNF598的RPS10單泛素化。相反，過量表達(dá)C端Myc標(biāo)記的野生型、K214R、K227R、K230R或K227R/K230RPS3的親本細(xì)胞中的報告蛋白表達(dá)沒有改變，表明無論RPS3單泛素化如何，對碰撞和活性RQC的感應(yīng)沒有受到干擾。

研究結(jié)論：USP10或G3BP1系列RBP不會損害功能RQC。

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6.ZNF598介導(dǎo)的核糖體碰撞感知是培養(yǎng)細(xì)胞中RPS2、RPS3和RPS10單泛素化的主要原因?? ?

????????為了確定依賴ZNF598的40SRP單泛素化的程度，用低劑量或高劑量的翻譯延伸抑制劑茴香霉素處理親本、USP10-KO 和USP10-ZNF598-DKO 細(xì)胞，以誘導(dǎo)核糖體停滯和不同程度的核糖體碰撞。低劑量茴香霉素處理已顯示以ZNF598依賴性方式刺激核糖體碰撞和RPS10泛素化，而高劑量茴香霉素處理誘導(dǎo)所有核糖體急性停滯，幾乎沒有核糖體碰撞和RPS10泛素化。在親本細(xì)胞中，作者證實低劑量茴香霉素處理比高劑量處理誘導(dǎo)更強的RPS10單泛素化。茴香霉素誘導(dǎo)的RPS2和RPS3單泛素化與劑量無關(guān)，表明RPS2和RPS3單泛素化也與核糖體碰撞無關(guān)。? ? ?

????????在USP10-KO細(xì)胞中KO ZNF598可以防止RPS10的單泛化，然而，一些殘留的RPS2和RPS3的單泛素化仍然存在，其對茴香霉素處理不敏感。同樣，在USP10-KO 細(xì)胞中Myc標(biāo)記的K138R-RPS10的表達(dá)也降低了RPS2和RPS3單泛素化水平。殘留的單泛素化表明存在未知的E3連接酶，優(yōu)先靶向在ZNF598介導(dǎo)的RPS10單泛素化后進(jìn)入RQC的碰撞核糖體。

研究結(jié)論：ZNF598介導(dǎo)的核糖體碰撞感知是細(xì)胞中RPS2、RPS3和RPS10單泛素化的主要原因。

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7.40SRP 的去泛素化發(fā)生在依賴RQC的核糖體解離的下游

????????RQC是協(xié)調(diào)停滯的核糖體解離和異常mRNA和新生多肽降解的有序過程。核糖體亞基解離需要 PELO、HBS1L 和 ABCE1 蛋白。與親本細(xì)胞相比，PELO-KO 細(xì)胞顯示出80S 核糖體的強烈積累，這些核糖體也富含單泛素化RPS3。盡管USP10-KO 和USP10-PELO-DKO 顯示出更高水平的RPS3泛素化，但在除PELOKO、G3BP1/2-DKO 或USP10-KO 之外的細(xì)胞系中未觀察到單泛素化RP的積累，這表明組裝的核糖體不受G3BP1家族-USP10復(fù)合物去泛素化的影響，包括進(jìn)入RQC的停滯核糖體。

????????另一方面，在不存在ZNF598和 PELO 的情況下，G3BP1的RNA交聯(lián)強度顯著降低，這表明進(jìn)入RQC并隨后進(jìn)行核糖體分解，這對于暴露mRNA和 18S rRNA進(jìn)行交聯(lián)是必要的。用K214R-RPS3取代RPS3，防止ZNF598誘導(dǎo)的RPS2和RPS3單泛素化不會損害G3BP1交聯(lián)效率，更下游的RQC因子NEMF或LTN1的KO也沒有影響。

研究結(jié)論：G3BP1-家族-USP10-復(fù)合物在碰撞的核糖體分解后優(yōu)先被招募到mRNA結(jié)合的40S亞基上。進(jìn)入RQC的40S亞基的去泛素化阻止了它們在溶酶體中的周轉(zhuǎn)，并使它們恢復(fù)到將來用于翻譯的狀態(tài)。

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結(jié)論與討論

在這里，作者探究了G3BP1家族-USP10復(fù)合物在RQC產(chǎn)生的40S亞基中RPS2、RPS3和RPS10位點特異性去泛素化的功能，以及一個替代核糖體單泛素化的過程。G3BP1家族RBP或USP10的KO導(dǎo)致40S亞基的溶酶體降解，從而導(dǎo)致核糖體亞基化學(xué)計量學(xué)紊亂。RPS3的單個K214R替換阻止了其單泛素化,恢復(fù)了40S亞基的周轉(zhuǎn)。總之，恢復(fù)翻譯停滯的核糖體的過程通過G3BP1家族-USP10復(fù)合物對40SRP進(jìn)行去泛素化,以防止40S亞基程序性溶酶體降解。

Thank you!

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.12.024