孤獨(dú)癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）是一組復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，包括自閉癥、阿斯伯格綜合征和待分類的廣泛性發(fā)展障礙，表現(xiàn)出社會(huì)交往障礙、言語(yǔ)交流障礙、重復(fù)性刻板行為等癥狀，對(duì)兒童的健康發(fā)育、家庭的經(jīng)濟(jì)和精神帶來很大的影響。因此，探索ASD的發(fā)病機(jī)制為ASD的有效預(yù)防和早期干擾提供理論基礎(chǔ)刻不容緩。

突觸功能障礙被認(rèn)為是ASD和其他神經(jīng)發(fā)育障礙的關(guān)鍵生理致病機(jī)制，與之相關(guān)的基因有編碼神經(jīng)連接蛋白（Neuroligin，NLGN）和編碼神經(jīng)突觸蛋白（Neurexin，NRXN）的基因，其中NLGN3基因上的R451C突變已被證實(shí)會(huì)引起小鼠社交障礙、神經(jīng)突觸傳遞異常等與ASD密切相關(guān)的特征，但尚未驗(yàn)證該突變?cè)谌祟惿窠?jīng)元中是否有同樣影響。

中南大學(xué)的陳超教授團(tuán)隊(duì)與斯坦福大學(xué)Thomas C. Südhof教授、美國(guó)羅格斯大學(xué)Zhiping Pang教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)手對(duì)此展開研究，并在Molecular Psychiatry上聯(lián)合發(fā)表了題為“Analyses of the autism-associated neuroligin-3 R451C mutation in human neurons reveal a gain-of-function synaptic mechanism”的文章。

他們利用人源胚胎干細(xì)胞的多向分化潛能，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立了NLGN3 R451C突變神經(jīng)元模型，發(fā)現(xiàn)敲入NLGN3 R451C突變后，細(xì)胞內(nèi)的NLGN3蛋白水平顯著下降，興奮性突觸傳遞增強(qiáng)，并驗(yàn)證了該突變?yōu)锳SD相關(guān)關(guān)鍵細(xì)胞表型，為ASD治療策略開發(fā)提供理論依據(jù)。

NLGN3 R451C突變引起興奮性突觸數(shù)量及傳遞強(qiáng)度增加

研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將R451C突變敲入人類H1細(xì)胞中，確認(rèn)NGLN3 R451C突變H1細(xì)胞的多能性未被破壞且未有脫靶突變后，采用iN細(xì)胞技術(shù)將對(duì)照細(xì)胞和NLGN3 R451C突變的H1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元。

共同培養(yǎng)這兩種神經(jīng)元，對(duì)其蛋白水平、基因表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：與NLGN3 R541C突變敲入小鼠模型中觀察到的結(jié)果一致，敲入R451C突變會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)NLGN3蛋白水平顯著下降（圖1e）。但qPCR的結(jié)果顯示敲入NLGN3 R451C突變不會(huì)改變NLGN mRNA的水平（圖S2），這說明NLGN3 R451C突變是通過影響NLGN3蛋白的穩(wěn)定性引起蛋白水平下降的。

接著，為了研究受NLGN3 R451C突變影響而胞內(nèi)NLGN3蛋白水平下降的神經(jīng)元是否存在功能障礙，研究人員通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)和形態(tài)學(xué)對(duì)突變神經(jīng)元和對(duì)照神經(jīng)元進(jìn)行了分析。他們發(fā)現(xiàn)NLGN3 R451C突變神經(jīng)元的固有點(diǎn)響應(yīng)特性、對(duì)電刺激響應(yīng)的動(dòng)作電位與對(duì)照神經(jīng)元相似（圖1f，圖2c-e），但有且僅有突變株的興奮性突觸數(shù)量增多（圖1g-i）。

對(duì)NLGN R451C突變神經(jīng)元和對(duì)照神經(jīng)元的自發(fā)興奮性突觸后電位（sEPSCs）和抑制性突觸后電流進(jìn)行記錄和分析發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照神經(jīng)元相比，NLGN R451C突變神經(jīng)元的sEPSCs頻率大幅增加，而sIPSCs則沒有明顯差異（圖2f-i）。在加入河豚毒素作為刺激源的實(shí)驗(yàn)中觀察到相似的結(jié)果，表明：在人類神經(jīng)元中NLGN3 R451C突變可通過增加興奮性突觸數(shù)量來增強(qiáng)興奮性突觸傳遞的強(qiáng)度，從而打破突觸興奮/抑制傳遞平衡，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。

基于上述結(jié)果，研究人員猜測(cè)NLGN3 R451C突變可能通過影響NLGN3蛋白的穩(wěn)定性誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)神經(jīng)元造成重大損害導(dǎo)致ASD。但他們驗(yàn)證后排除了這一推測(cè)，并對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行了別的摸索。

源井已成功在多種干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因編輯，積累了豐富的干細(xì)胞培養(yǎng)及基因編輯經(jīng)驗(yàn)，采用精研干細(xì)胞培養(yǎng)基，保留干性的同時(shí)保證細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后狀態(tài)如初，獨(dú)家CRISPR-U?技術(shù)提高基因編輯效率達(dá)10倍，輕松交付優(yōu)質(zhì)iPS/ES基因編輯純合克?。?strong>基因敲除/敲入/點(diǎn)突變均可定制，神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞模型構(gòu)建不再難！歡迎復(fù)制鏈接了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/cell/3107.html?bilibiliASD

將NLGN3 R451C突變神經(jīng)元移植至小鼠大腦中驗(yàn)證細(xì)胞水平結(jié)果

研究人員將表達(dá)mCherry的對(duì)照興奮性神經(jīng)元和表達(dá)mVenus的NLGN3 R451C突變興奮性神經(jīng)元一同移植到RAG2免疫缺陷新生小鼠的海馬體中（圖4a），并在6周后通過成像、電生理學(xué)、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行分析。

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)元在形態(tài)和功能上已成功整合到小鼠的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中，既能接收興奮性突觸傳遞也能接收抑制性突觸傳遞。不僅如此，研究人員觀察到了與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中一樣的現(xiàn)象：相比于對(duì)照神經(jīng)元，NLGN R451突變神經(jīng)元的sEPSC頻率更高，但振幅沒有顯著差異（圖4e-i）。進(jìn)一步證實(shí)了NLGN3 R451C突變?cè)谌祟惿窠?jīng)元中產(chǎn)生的影響與在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的影響是一致的，也表明NLGN3 R451C突變是ASD相關(guān)功能獲得性表型。

NLGN3 R451C突變對(duì)興奮性神經(jīng)元的影響更大

為了研究NLGN3 R451C突變?cè)谌祟惿窠?jīng)元中產(chǎn)生的影響與突觸表型相關(guān)基因的關(guān)系，研究人員使用單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)w外共培養(yǎng)的對(duì)照組和突變組神經(jīng)元進(jìn)行分析，得到基因富集圖譜和基因表達(dá)差異結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示差異表達(dá)基因在不同類型神經(jīng)元中是不同的，提示NLGN3 R451C突變可能對(duì)不同類型神經(jīng)元產(chǎn)生的影響不同（圖5d）。而后用SynGo進(jìn)行深度分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因中突觸功能相關(guān)的居多。不僅如此，他們發(fā)現(xiàn)興奮性NLGN3 R451C突變神經(jīng)元比抑制性NLGN3 R451C突變神經(jīng)元顯示出更高的突觸功能基因富集（圖5e），且興奮性NLGN3 R451C突變神經(jīng)元的基因表達(dá)差異更大，這表明NLGN3 R451C突變可能對(duì)興奮性神經(jīng)元的基因表達(dá)差異影響更大，也從側(cè)面驗(yàn)證了NLGN3 R451C突變是通過影響興奮性神經(jīng)元突觸傳遞引起神經(jīng)元功能障礙的。

NLGN3 R451C突變?cè)赟CZ、BP、ASD等精神障礙的生理病理發(fā)展中起關(guān)鍵作用

研究人員還通過包括遺傳學(xué)、差異表達(dá)、共表達(dá)在內(nèi)多種類型的數(shù)據(jù)對(duì)NLGN3 R451C突變引起的基因表達(dá)差異與精神疾病的關(guān)系展開了研究，他們發(fā)現(xiàn)被NLGN3 R451C突變影響的與突觸功能相關(guān)的趨同基因網(wǎng)絡(luò)在精神分裂癥、雙相情感障礙、孤獨(dú)癥譜系障礙等多種精神障礙的生理病理進(jìn)程中都起著關(guān)鍵性作用。這也從另一方面驗(yàn)證了NLGN3 R451C突變是精神障礙疾病的關(guān)鍵細(xì)胞表型。

該研究巧妙結(jié)合人源胚胎干細(xì)胞的多向分化潛能特性及CRISPR/Cas9技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了NLGN3 R451C突變神經(jīng)元模型以研究NLGN3 R451C突變對(duì)人類神經(jīng)元的影響，揭示了NLGN3 R451C突變是ASD細(xì)胞的關(guān)鍵功能獲得性表型、對(duì)興奮性神經(jīng)元突觸傳遞有增強(qiáng)作用，填補(bǔ)了人源細(xì)胞NLGN3 R451C突變的研究空缺，為ASD預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

除了H1/H9/iPS等干細(xì)胞的基因編輯服務(wù)，源井還能提供超200種腫瘤細(xì)胞的基因敲除細(xì)胞系、基因敲入細(xì)胞系、基因點(diǎn)突變細(xì)胞系、基因過表達(dá)細(xì)胞系、基因干擾細(xì)胞系定制服務(wù)，助力細(xì)胞疾病模型構(gòu)建，快至4周交付優(yōu)質(zhì)純合。歡迎復(fù)制鏈接了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/cell/knockout.html?bilibiliASD

原文：https://www.ubigene.com/literature/5244.html?bilibiliASD