百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，SWATHtoMRM: Development of High-Coverage Targeted Metabolomics Method Using SWATH Technology for Biomarker Discovery，是由中國科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心，Dr. Zheng-Jiang Zhu課題組發(fā)表在AC上的一篇技術(shù)型文章。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—摘要

生物樣本代謝組存在高度復(fù)雜性，對大規(guī)模定量研究這些代謝物帶來極大的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重限制了代謝組學(xué)在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究中的運(yùn)用。靶向代謝組學(xué)研究主要運(yùn)用MRM技術(shù)，具有極高的定量能力，但卻受制于較為有限的覆蓋度。為了解決這一挑戰(zhàn)，作者開發(fā)了一項(xiàng)新的技術(shù)策略——SWATHtoMRM，巧妙的運(yùn)用了SWATH技術(shù)的高覆蓋度特點(diǎn)來開發(fā)高覆蓋度的靶向代謝組學(xué)方法。

首先，運(yùn)用SWATH技術(shù)對一個生物混樣進(jìn)行非靶向代謝譜分析，以獲取其中“所有”代謝物的二級譜圖 (MS2)；然后從中提取MRM離子對信息，用于構(gòu)建高達(dá)1000-2000代謝物覆蓋度的靶向代謝組學(xué)分析；隨后，作者又展示了這種方法在定量代謝組學(xué)中優(yōu)勢，例如：覆蓋度、重復(fù)性、靈敏度和動態(tài)范圍等。最后，作者運(yùn)用SWATHtoMRM技術(shù)尋找colorectal cancer (CRC)診斷標(biāo)志物，單針進(jìn)樣便可完成多達(dá)1303種代謝物MRM檢測。從CRC病人組織中發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了20種潛在診斷標(biāo)志物。其中17種標(biāo)志代謝物在CRC病人血漿中被進(jìn)一步驗(yàn)證與腫瘤切除相關(guān)，有著極大的CRC術(shù)后預(yù)后標(biāo)志物潛力。

SWATHtoMRM技術(shù)為我們提供了一種全新的途徑來開發(fā)高覆蓋度的靶向代謝組學(xué)方法，將促進(jìn)靶向代謝組學(xué)在疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究中的應(yīng)用。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—背景

代謝組學(xué)旨在系統(tǒng)性定量檢測所有代謝物的動態(tài)變化，為疾病表型提供一個綜合的特征描述，以便于疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。代謝物具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性和懸殊的濃度范圍（>109）。因此，代謝組學(xué)研究要求分析技術(shù)具有廣泛覆蓋度、高靈敏性和特異性以及寬動態(tài)范圍。

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)是較為流行的代謝譜分析技術(shù)之一，包括靶向和非靶向兩種方式。非靶向代謝組學(xué)多運(yùn)用高分辨質(zhì)譜（TOF/Orbitrap）來檢測盡量多的代謝物，具有很寬的覆蓋度，但是受限于動態(tài)范圍、定量精度以及靈敏度等。相反，基于LC-MS的靶向代謝組學(xué)技術(shù)主要使用MRM技術(shù)，能夠精確定量一定數(shù)量（100-300）的已知代謝物。

靶向代謝組學(xué)技術(shù)作為代謝物定量的金標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的靈敏度、動態(tài)范圍和較好的重現(xiàn)性。然而，較低的代謝物覆蓋度成為了靶向代謝組學(xué)的主要運(yùn)用瓶頸，因此，開發(fā)一種具有高覆蓋度的靶向方法來準(zhǔn)確定量在非靶向代謝組學(xué)中檢測到的已知/未知代謝物至關(guān)重要。

針對MRM覆蓋度低這一瓶頸，近期已有多篇文章著手開發(fā)高覆蓋度的靶向代謝組學(xué)技術(shù)。 但這些技術(shù)往往需要很長的機(jī)時（20-30針， 有的甚至需要80針）來獲取代謝物的二級譜圖，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的通量；使用常規(guī)的DDA采集模式來獲取代謝物二級譜圖也是這些方法中的一種，但由于DDA模式本身的隨機(jī)性和偏好性，使得這種采集方式重復(fù)性低，覆蓋度也偏低。不同于DDA采集模式，DIA/SWATH模式能夠高效、高覆蓋度獲取“所有”代謝物的二級譜圖，在近幾年被不斷開發(fā)用于非靶向代謝組學(xué)研究。

盡管SWATH技術(shù)能夠同時采集所有代謝物的二級碎片離子信息，但是在復(fù)雜生物樣品中，它的定量動態(tài)范圍和重復(fù)性都受到了很大的限制。正是由于任何單一技術(shù)都不是廣泛適用的，本文作者集各家之所長，將SWATH技術(shù)強(qiáng)大的定性能力與MRM技術(shù)的精確定量能力完美結(jié)合，開發(fā)出了SWATHtoMRM技術(shù)。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—方法

LC-MS方法

為了保證SWATH采集到的代謝物二級碎片離子信息與MRM中所使用的Q1/Q3離子對信息相對應(yīng)，需要保證液相條件（RT）完全一致，并盡量保證SWATH采集所使用的Q-TOF質(zhì)譜儀（TripleTOF 6600）與MRM采集所使用的QQQ質(zhì)譜儀（Agilent 6495 QQQ）具有相對一致的各項(xiàng)參數(shù)（CE，DP等）。

數(shù)據(jù)處理方法

SWATHtoMRM流程

SWATHtoMRM技術(shù)的分析流程已整理成R包，用于從SWATH數(shù)據(jù)中大規(guī)模提取MRM離子對信息，該R包可以在(http://www.zhulab.cn/software.php)下載安裝。整個流程分為兩步（圖1）：

圖1. (a) SWATHtoMRM 技術(shù)流程概覽。 (b) 從SWATH數(shù)據(jù)中提取虛擬MS2圖譜。 (c) 將來自多個樣品的MS2譜圖合并為consensus 譜圖，保留出現(xiàn)頻率超過50%的碎片離子，并用于生成MRM離子對。

1.非靶向分析SWATH數(shù)據(jù)

a) 使用XCMS包中的CentWave算法實(shí)現(xiàn)色譜峰（LC peak）識別，然后用CAMERA進(jìn)行質(zhì)譜峰（MS peak）注釋，并去除同位素峰和小于1000的弱信號峰。對于多個數(shù)據(jù)文件，使用OBI-Warp算法進(jìn)行峰對齊?！鶰S1 LC peak 。

b) 針對每一個MS1peak，從峰頂位置找到對應(yīng)RT的混合MS2譜圖，并過濾掉小于200的弱信號值、同位素離子以及大于母離子m/z的碎片離子。提取保留的碎片離子色譜峰（EIC）。→MS2 LC peak 。

c) 通過計(jì)算每一個碎片離子EIC與母離子EIC之間的相關(guān)性得分（PPC score），將得分大于0.8的碎片離子EIC和對應(yīng)母離子EIC歸為一組，得到peak group（一個母離子EIC +多個碎片離子EIC），然后對每個peak group生成一張?zhí)摂M二級譜圖?！?Pseudo MS2 spectrum。

d) 將來自多個樣品的相同MS1 peak的二級譜圖合并為一張譜圖（consensus MS2）。合并原則為：保留出現(xiàn)頻率超過50%的碎片離子，合并后的m/z為mean(m/z)，intensity %為 mean(intensity %)?！?Consensus MS2 spectrum。

2.生成MRM離子對信息

a) 采用3個原則評估consensus MS2中每一個碎片離子：（1）m/z(product ion)<m/z(precursor ion)-14.0126 Da，即在離子碎裂過程中至少有一個（CH?）基團(tuán)從母離子丟失；（2）剔除中性丟失H?O、NH?或者CO?產(chǎn)生的碎片離子（也可自定義其他類型）；（3）選擇剩余例子中強(qiáng)度最高的碎片離子作為MRM離子對。最后，使用Agilent MassHunter構(gòu)建schedule MRM方法，最小dwell 時間 5ms，cycle time為990ms。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—結(jié)果與討論

SWATHtoMRM 流程評估

首先，作者測試了SWATHtoMRM技術(shù)在多種生物樣品，例如，人類尿液、結(jié)腸直腸組織以及Jurkat細(xì)胞中的適用性。

以人尿液樣品為例，3554個MS1 feature在SWATH數(shù)據(jù)中被檢測到，其中950個同位素峰和弱信號峰被初步過濾。剩余的2604個代謝物峰中，2091 (80.3%) 個代謝物具有合適的MRM離子對信息，其他代謝物峰由于不滿足PPC > 0.8這一條件被進(jìn)一步剔除。通過手動分析2091個MRM離子對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多達(dá)1614 (77.2%) 個代謝物成功在尿液樣品中檢測到（圖2a）。

類似的，在其他類型樣品中得到了接近的檢出率（76 - 80%）。 本次實(shí)驗(yàn)中僅采用了正離子模式，但負(fù)離子模式也是完全適用的。

圖2b詳細(xì)演示了通過SWATHtoMRM構(gòu)建MRM離子對的過程。 以taurine這個代謝物（m/z = 126.0212 Da，RT= 518 s）為例：首先，包含多個代謝物碎片離子的多重二級譜圖被提取出來。然后根據(jù)與母離子EIC之間的相關(guān)性PPC，保留得分大于0.8 的碎片離子。隨后，將來自多個樣品的同一代謝物二級譜圖合并，得到一張包含13個碎片離子的consensus二級譜圖。最后，從中選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高的碎片離子（m/z = 44.0496 Da）構(gòu)建taurine的MRM離子對（Q1/Q3， 126.0/44.0）。

圖2. (a) 使用人尿液樣品大規(guī)模生成MRM離子對。(b) 代謝物taurine的離子對生成過程。 (c) 從不同類型生物樣品（尿液，組織和細(xì)胞）中檢測到的MRM離子對統(tǒng)計(jì)信息。

SWATHtoMRM技術(shù)的覆蓋度評估

為了證實(shí)這一技術(shù)具有廣泛的覆蓋度，作者將SWATHtoMRM方法與DDA方法做了系統(tǒng)的比較。使用相同的尿液樣品，相同的儀器參數(shù)，連續(xù)采集SWATH和DDA數(shù)據(jù)。后續(xù)的數(shù)據(jù)分析也采用相似的參數(shù)自動化進(jìn)行，以較大的降低主觀偏好性。從相同的尿液樣品中，分別檢測出2604（SWATH）和2149（DDA）個feature（圖3a, 3b）。比較兩者的二級譜圖覆蓋度，SWATH（2105, 80.8%）顯著高于DDA（1174, 54.6%）。二級覆蓋度在兩者共享feature中，SWATH（84.9%）也顯著高于DDA（61.1%）。

SWATH與DDA技術(shù)分別成功構(gòu)建2091和1163個MRM離子對，其中852個是共享離子對（圖3c）。在這852個共享離子對中，分別有87.2%（SWATH）和88.7%（DDA）的檢出率，兩種方法具有接近的檢出率，說明SWATH技術(shù)生成的MRM離子對信息是可靠的（圖3d）。 但是從總檢出數(shù)上來看，SWATH技術(shù)比DDA多出66%的代謝物。簡言之，SWATH技術(shù)具有與DDA相似的數(shù)據(jù)質(zhì)量，同時又顯著超越了DDA的檢測數(shù)量。

圖3. 從SWATH數(shù)據(jù)中生成的MRM離子對具有很廣的覆蓋度。(a) 韋恩圖展示了SWATH與DDA技術(shù)檢測到的共享和特有feature。(b) SWATH與DDA數(shù)據(jù)中MS1和MS2的分布圖。紅/藍(lán)=有MS2，灰色=無MS2。(c) 兩種方法構(gòu)建的MRM離子對數(shù)目比較。(d) 兩種方法檢測到的代謝物數(shù)目比較。

SWATHtoMRM定量性能評估

為了評估SWATHtoMRM技術(shù)的定量性能，作者對比了SWATHtoMRM，SWATH-MS1以及SWATH-MS2 3種技術(shù)間的靈敏度、動態(tài)范圍和重復(fù)性。首先，梯度稀釋尿液樣品，分別進(jìn)行SWATHtoMRM和SWATH采集，然后隨機(jī)選擇629個檢測到的代謝物進(jìn)行比較。

1.靈敏度：比較不同稀釋梯度中代謝物檢出數(shù)來評估，結(jié)果SWATHtoMRM > SWATH-MS1= SWATH-MS2（圖4a）。將這一比較細(xì)化到不同豐度范圍代謝物中，同樣是SWATHtoMRM優(yōu)勝，尤其是在低豐度代謝物中（圖4b）。

2.動態(tài)范圍：比較不同稀釋梯度中，629個代謝物的定量線性范圍（R2）來評估，結(jié)果SWATHtoMRM > SWATH-MS1> SWATH-MS2，SWATHtoMRM數(shù)據(jù)中R2> 0.8的代謝物超過了80%，而SWATH-MS1和SWATH-MS2則不到60%（圖4c）。

3.重復(fù)性：通過比較相鄰稀釋梯度的代謝物檢出強(qiáng)度比值來評估。統(tǒng)計(jì)629個代謝物在兩組相鄰稀釋梯度間檢出強(qiáng)度比值（4×:16×、16×:64×，log2(理論值)=2），結(jié)果表明SWATHtoMRM > SWATH-MS1> SWATH-MS2，SWATHtoMRM技術(shù)在不同的稀釋梯度組合中具有接近的中位值以及較窄的分布，同時SWATH-MS1也是優(yōu)于SWATH-MS2的，SWATH-MS2在16×:64×組合中，比值中位數(shù)已經(jīng)嚴(yán)重偏離了理論值（4倍），并且具有很寬的分布范圍（圖4e）。

圖4. SWATHtoMRM技術(shù)定量性能評估。(a) 3種方法在不同稀釋梯度中的代謝物檢出數(shù)比較。 (b) 細(xì)化到不同豐度范圍時代謝物檢出數(shù)。(c)R2累積分布，從R2=1到R2=0.8，滿足條件的代謝物數(shù)目逐漸增多。(d) 列舉了兩種實(shí)際代謝物的定量線性范圍。(e) 兩個相鄰稀釋梯度間的比值分布圖。

SWATHtoMRM實(shí)用性評估

為了評估SWATHtoMRM技術(shù)的實(shí)用性能，作者將該技術(shù)運(yùn)用于結(jié)腸癌（CRC）診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)研究（18對樣品作為訓(xùn)練集，42對用作驗(yàn)證集）。利用pooled QC樣品構(gòu)建了1705個MRM離子對，并成功檢測到了其中的1303（76.4%）個代謝物。總共有1213（93.1%）個代謝物在>4個實(shí)際組織樣品中加測到，并用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。從QC樣品的RSD以及PCA分析結(jié)果來看，SWATHtoMRM在重復(fù)性和靈敏度方面顯著優(yōu)于SWATH-MS1技術(shù)，主要表現(xiàn)在更低中位RSD值和較窄的RSD分布（圖5a），以及PCA得分圖中更小的組內(nèi)離散度和更大的組間分離度（圖5b）。

在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究階段，1303個代謝物中有358個具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（fold-change >1.5， p-value > 0.01），其中67個被成功鑒定。隨后，使用PLS-DA模型分析了CRC癌組織與癌旁組織的代謝物差異，VIP最高的20個代謝物被定義為潛在生物標(biāo)志物（圖5d），并具有極好的辨別能力（AUC = 1）。接下來，作者在驗(yàn)證集樣品中檢測了這20個代謝物，并評估了其預(yù)測精度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些代謝物在驗(yàn)證集樣品中同樣具有極好的辨別能力（AUC=0.998，95% CI）（圖5e）。

最后，作者使用CRC病人手術(shù)切除前后血漿樣品來評估了這些代謝物的預(yù)后標(biāo)志物潛力。其中17個代謝物表現(xiàn)出可靠的預(yù)測能力（AUC = 0.779，95% CI，sensitivity = 91.2%，specificity = 64.7%）（圖5f）。

圖5. (a) QC樣品中檢測到的1213個代謝物RSD值分布。(b) 分別使用SWATH-MS1和SWATHtoMRM技術(shù)檢測癌組織和癌旁組織中代謝物得到的PCA打分。(c)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究的SWATHtoMRM實(shí)驗(yàn)流程。(d) 火山圖展示1213個檢測到的代謝物，紅色點(diǎn)表示定義的20個潛在生物標(biāo)志物。(e) 使用驗(yàn)證集組織樣品的20個代謝物構(gòu)建的PLS預(yù)測模型ROC曲線（左）和概率分布圖（右）。(f) 使用驗(yàn)證集血漿樣品的17個代謝物構(gòu)建的PLS預(yù)測模型ROC曲線（左）和概率分布圖（右）。

代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享—總結(jié)

作者開發(fā)了一種新的靶向代謝組學(xué)技術(shù)—SWATHtoMRM，可同時檢測高達(dá)1000-2000個代謝物。并從多個角度詳細(xì)對比了SWATHtoMRM與DDA、SWATH-MS1以及SWATH-MS2技術(shù)之間的優(yōu)劣。與DDA相比，SWATHtoMRM技術(shù)能夠構(gòu)建更多的MRM離子對。而與SWATH-MS技術(shù)相比，SWATHtoMRM具有更好的重復(fù)性、更高的靈敏度和更廣的覆蓋度。同時通過實(shí)際案例探究了該方法在代謝物生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究中的巨大潛力。