記得讀研究生時(shí)，

實(shí)驗(yàn)室的規(guī)矩之一

就是新手要負(fù)責(zé)制備公用的感受態(tài)細(xì)胞，

即使有師兄師姐帶著做，

結(jié)果仍然被鄙視。

心里不免產(chǎn)生一個(gè)疑問，

同樣的protocol,

為啥我做的感受態(tài)就是不行？

作為新手的我們，

要想制備一款敏感卻不脆弱的感受態(tài)，

得先了解

感受態(tài)細(xì)胞是什么

↓

理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于容易吸收外源DNA的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞。

感受態(tài)細(xì)胞制備的常用方法

目前制備感受態(tài)細(xì)胞常用的方法有RbCl (KCl)法、CaCl2法、電擊感受態(tài)法等。其中，RbCl (KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但制備較復(fù)雜，不適合實(shí)驗(yàn)室用；CaCl2法簡便易行，且轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)要求，使用廣泛；電擊感受態(tài)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，操作簡單，需要電擊儀進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化工作。因此實(shí)驗(yàn)室感受態(tài)制備常用的兩種方法就是CaCl2法和電擊法。

實(shí)驗(yàn)室常用的有大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體制備方法如下所示：

大腸桿菌感受態(tài)的制備（化轉(zhuǎn)感受態(tài)）

1. 挑取宿主菌單菌落接種于3-5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12 h左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2-3 h至OD600在0.4-0.6之間。

2. 將培養(yǎng)液置于冰上放置30 min，然后于4 ℃下4000 r/min離心10 min，收菌。

3. 按3 mL菌液/1 mL的CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30 min后，4 ℃下4000 r/min離心5 min，棄去上清。

4. 加入700 μL的CaCl2輕輕懸浮細(xì)胞，加入300 μL的甘油混合均勻，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。

5. 感受態(tài)細(xì)胞分裝成100 μL的小份，貯存于-80 ℃可保存半年。

畢赤酵母感受態(tài)的制備（電擊感受態(tài)）

1. 從-80 ?℃超低溫冰箱中取出保存于甘油管中的畢赤酵母GS115或X-33，在YPD平板上劃線，30?℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3天。

2. 挑取單菌落，接種在5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ?℃振蕩培養(yǎng)18-24 h。

3. 取80-120 μL過夜培養(yǎng)物，接種到100 mL液體YPD培養(yǎng)基中，過夜生長至OD600?＝1.15-1.5之間（最好是1.3），將細(xì)胞置4 ?℃或冰上放置10 min。

4. 4 ?℃下在2000 g離心5 min，收集細(xì)胞。加入100 mL冰冷的無菌水輕輕使菌體懸浮，再按上步離心。

5. 加入50 mL冰冷的無菌水懸浮清洗，兩管合并到一管，再按上步離心，棄上清。

6. 細(xì)胞懸浮于40 mL 1 M冰冷的山梨醇，依上步離心后，再懸浮于20 mL 1 M冰冷的山梨醇，按上步離心，去上清。

7. 用大約100-200 μL的1 M冰冷的山梨醇重懸細(xì)胞，使細(xì)胞終濃度達(dá)到1×1010 cells/mL，放置在冰上備用（僅當(dāng)天使用）（一般先加100 μL重懸，若細(xì)胞比較粘稠吸附不起來，再適當(dāng)加50-100 μL）。

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

1. 挑取宿主菌接種于3 mL 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。

2. 從過夜培養(yǎng)物中取100 μL菌液，接種至用50 mL 離心管配好的5 mL SPI Medium中，37℃搖床培養(yǎng)，3 h后開始測OD600，當(dāng)培養(yǎng)物生長到對數(shù)末期時(shí)約4.5 h，快速取200 μL接種到2 mL SP II Medium中，于37℃ 100 rpm搖床培養(yǎng)1.5 h。

3. 加20 μL 100×EGTA溶液，于37℃ 100 rpm搖床培養(yǎng)10 min，用1.5 mL離心管分裝成500 μL每管。

4. 向管中加入適量的質(zhì)粒，輕輕混勻于37℃ 100 rpm搖床培養(yǎng)30 min。

5. 將離心管轉(zhuǎn)移到250 rpm搖床，37℃培養(yǎng)1.5 h。

6. 以4000 rpm離心收集菌體，棄部分上清液，留100 μL重懸菌體，涂相應(yīng)的選擇性平板，37℃過夜培養(yǎng)。

地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備?

1. 挑取宿主菌單菌落至10 mL枯草芽孢桿菌基本培養(yǎng)基中，37℃ 劇烈振蕩培養(yǎng)16~18 h，250 ?r/min，培養(yǎng)至OD600為1.0。

2. 取1.5 mL該培養(yǎng)液加入到10 mL 37℃ 水浴預(yù)熱的40 mL新鮮枯草芽孢桿菌基本培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4 h，250 r/min。

3. 加入 10 mL芽孢桿菌饑餓培養(yǎng)基，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4 h，250 r/min。

4. 將細(xì)菌在冰水浴冷卻15 min，分裝于0.5 mL Eppendorf 管中，于4℃ 10000 r/min 離心10 min，用預(yù)冷的水輕輕溶解懸浮，可直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也可于-80℃凍存。

看起來protocol都很簡單，

但制備的感受態(tài)效果卻千差萬別，

原因可能就是你沒有注意到一些實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。

↓

注意事項(xiàng)01

細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為宜，可通過檢測培養(yǎng)液的OD600來控制，如DH5α菌株的細(xì)胞密度在5×107個(gè)/mL左右就比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。

02

實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心：懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化效率。

03

制備好的感受態(tài)最好一次分裝后快速冷凍于-80℃，反復(fù)凍融會極大地影響轉(zhuǎn)化效率。

04

從離心機(jī)拿出離心管時(shí)應(yīng)立即插入冰中，再拿到超凈臺，操作時(shí)不要用手觸摸管底的菌體沉淀并保持無菌操作。

05

離心機(jī)和離心管要提前半小時(shí)預(yù)冷。

06

整個(gè)制備過程不要染菌，制備結(jié)束后，可在相應(yīng)的平板上涂一支感受態(tài)細(xì)胞，檢測其是否染菌。

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