從發(fā)根不完全的第三磨牙中分離出兩個(gè)根尖乳頭細(xì)胞群，并在四種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng):最低必需Eagle培養(yǎng)基-α改良(α-MEM)；補(bǔ)充有FBS的α-MEM；杜爾貝克改良型Eagle培養(yǎng)基/營(yíng)養(yǎng)混合物F-12(DMEM/F12)；以及DMEM/F12輔以FBS (DMEM/F12 + FBS)。我們?cè)u(píng)估了它們的增殖、克隆形成能力以及體外成骨和軟骨分化潛能。

細(xì)胞增殖和生存測(cè)定

A和B顯示缺乏FBS補(bǔ)充抑制了兩個(gè)群體中菌落單位的形成。C和D顯示了染料的定量。數(shù)據(jù)以平均值±SD(豎線)表示，星號(hào)表示顯著差異(*p < 0.0001)。當(dāng)比較所有組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線時(shí)，我們觀察到AP1和AP2兩個(gè)群體在24小時(shí)后沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。48小時(shí)后，DMEM/F12胎牛血清組的增殖能力高于α-MEM組(p < 0.001)。在AP1人群中，與α-MEM相比，α-MEM- FBS和DMEM/F12組也更具增殖性(p < 0.007)。72小時(shí)后，DMEM/ F12 +胎牛血清和α-MEM+胎牛血清組顯示出較高的增殖對(duì)于兩個(gè)群體來(lái)說(shuō)，比在沒(méi)有FBS的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞更有潛力(p < 0.002)。AP2阿爾法MEM FBS組顯示最高，72小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)，與DMEM/F12 FBS相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.0001)。對(duì)于AP1，DMEM/F12表現(xiàn)出比α-MEM更高的增殖能力(p < 0.001)，DMEM/F12 FBS具有最高的細(xì)胞數(shù)量，盡管這個(gè)結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p 0.3)。在通過(guò)MTS試驗(yàn)進(jìn)行的細(xì)胞活力評(píng)估中，在24小時(shí)時(shí)，在兩個(gè)群體的組中沒(méi)有觀察到差異。48小時(shí)后，在AP1群體中，α-MEM FBS和DMEM/F12 FBS組表現(xiàn)出比未補(bǔ)充組更高數(shù)量的活細(xì)胞。對(duì)于AP2人群，DMEM/ F12 FBS和DMEM/ F12之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p 0.13)。72小時(shí)后觀察到相同的趨勢(shì)，其中在AP1群體中，在α-MEM+FBS中培養(yǎng)的細(xì)胞比那些培養(yǎng)的細(xì)胞更有活力在DMEM/F12 +胎牛血清中(p < 0.001)。對(duì)于AP2，這兩組中活細(xì)胞的數(shù)量相似(p = 0.9)。

菌落形成試驗(yàn)

在A和B中，有絲分裂標(biāo)記PHH3的免疫熒光染色的代表性圖像，顯示了兩個(gè)群體的所有組中的陽(yáng)性細(xì)胞核(FITC，400倍放大)。在C和D中，細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，在用FBS補(bǔ)充物培養(yǎng)的組中，陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量更高。數(shù)據(jù)以平均值SD(豎線)表示，星號(hào)表示顯著差異(*p < 0.0001，**p < 0.001，***p < 0.05)。7天后，在兩個(gè)群體中，菌落僅存在于用FBS補(bǔ)充培養(yǎng)的組中。在AP2，阿爾法MEM FBS是在菌落形成方面比DMEM/F12 FBS更有效(p < 0.0001)。在AP1人群中，這兩組之間的差異并不顯著統(tǒng)計(jì)顯著性(p = 0.3)。

成骨分化

為了評(píng)估群體的成骨分化潛能，誘導(dǎo)21天后，用茜素紅對(duì)沉積物進(jìn)行染色。所有組均顯示礦化結(jié)構(gòu)。在這兩個(gè)版本中，阿爾法-MEM、阿爾法-MEM+FBS和DMEM/F12各組比DMEM/F12+FBS組顯示更多的礦化沉積(p < 0.05)。在AP2，與在α-MEM(p 0.02)和DMEM/F12胎牛血清中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在α-MEM胎牛血清中培養(yǎng)的細(xì)胞也顯示出更高的礦化度(p < 0.0001)。此外，α-MEM組比DMEM/F12 + FBS組顯示出更高數(shù)量的礦化結(jié)構(gòu)(p < 0.0001)。

軟骨分化

對(duì)于21天軟骨形成誘導(dǎo)的定性評(píng)估，福爾馬林固定的石蠟包埋切片用甲苯胺藍(lán)染色，甲苯胺藍(lán)是一種對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的蛋白聚糖和糖胺聚糖具有親和力的染料。在兩個(gè)群體中，只有補(bǔ)充血清的群體能夠形成球體。然而，只有AP1顯示輕微的粉紅色，表明這些細(xì)胞的軟骨形成分化。

由數(shù)據(jù)可以得到，在DMEM/F12 +胎牛血清和α-MEM+胎牛血清中培養(yǎng)的根尖乳頭細(xì)胞比在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，在集落細(xì)胞形成中也表現(xiàn)出更高的效率。盡管如此，所有研究組都顯示了有絲分裂標(biāo)記抗PHH3的免疫染色。此外，α-MEM+胎牛血清、α-MEM和DMEM/F12 +胎牛血清在體外顯示出比DMEM/F12更高的礦化沉積量，而只有用胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞能夠在軟骨形成分化試驗(yàn)中形成球體。結(jié)論:我們的結(jié)果表明，盡管在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)根尖乳頭細(xì)胞降低了細(xì)胞增殖和分化的特性，但這些細(xì)胞仍然能夠保持其所需的特性。

作者：Cas9x海星生物

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