虛擬篩選高品質(zhì)化合物庫(kù)并進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，已成為尋找新的疾病研究方法的一種有效手段。ChemBridge作為深獲各國(guó)科學(xué)家贊許的化合物庫(kù)品牌，為全球科學(xué)家提供多種化合物實(shí)體庫(kù)及龐大的虛擬篩選數(shù)據(jù)庫(kù)，為探究復(fù)雜系統(tǒng)性疾病的理想研究手段提供穩(wěn)定可靠的苗頭/先導(dǎo)化合物。AbMole是ChemBridge在中國(guó)唯一官方指定合作伙伴。

福格特-小柳-原田?。╒ogt-Koyanagi-Harada,VKH）是種復(fù)雜的多系統(tǒng)自身免疫性疾病，發(fā)病快且致盲率高，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前，免疫抑制研究是VKH疾病的標(biāo)準(zhǔn)研究方法，然而，長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）參與VKH疾病的各個(gè)階段，主要表現(xiàn)為屏障功能損傷和色素沉著，在VKH的病因和研究中起關(guān)鍵作用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）是指通過引入特定的多能性基因，將已分化的細(xì)胞重編程為干細(xì)胞狀態(tài)。越來越多的研究使用iPSC進(jìn)行疾病建模，以探索疾病發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物研究。

重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院Wanqian Li、Peizeng Yang、Shengping Hou等在Clinical Immunology上發(fā)表了題為“iPSC-based model of Vogt-Koyanagi-Harada disease for phenotype recapitulation and drug screening”的研究論文，作者首先對(duì)VKH全基因組關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)EGR2位點(diǎn)與VKH的易感性高度相關(guān)。

研究人員通過提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），將其重編程為hiPSCs，再分化為RPE細(xì)胞，構(gòu)建了既具有人RPE功能又具有供體遺傳信息的hiPSC-RPE細(xì)胞，并以此作為VKH疾病細(xì)胞模型，研究VKH來源和正常來源的RPE的表型和功能特性。然后作者以EGR2為靶點(diǎn)，借助ChemBridge數(shù)據(jù)庫(kù)中的139萬種化合物，通過分子對(duì)接和高通量篩選，得到能夠特異性靶向EGR2的化合物，進(jìn)一步研究證實(shí)該化合物能夠改善hiPSC-RPE細(xì)胞RPE的功能，為VKH疾病的研究提供了新的策略。

為了獲得hiPSCs，研究人員首先提取和富集VKH病患和健康對(duì)照者的PBMC，然后導(dǎo)入三個(gè)游離質(zhì)粒（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL）和五種因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和MYCL）進(jìn)行重編程以獲得hiPSC（圖1A）。之后對(duì)hiPSC進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其具有正常的多能性，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)化（圖1B-F）。

為了將hiPSCs轉(zhuǎn)化為hiPSC-RPE，研究人員向hiPSC培養(yǎng)皿中加入LDN193189和SB431542，然后加入煙酰胺和激活素A誘導(dǎo)RPE分化，成功誘導(dǎo)hiPSC分化成功能性RPE細(xì)胞（圖2A）。經(jīng)過免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞表達(dá)RPE65、BEST1等RPE標(biāo)記基因（圖2B、C），表明RPE細(xì)胞分化成功，成功構(gòu)建hiPSC-RPE細(xì)胞模型。

為了研究VKH患者和健康人hiPSC-RPE細(xì)胞模型的表型和功能特征，研究人員通過RT-qPCR、Western blotting和免疫熒光進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VKH來源的RPE細(xì)胞中緊密連接蛋白減少（圖3A-C）、細(xì)胞屏障功能受損（圖3D）、色素顆粒減少（圖3E）、吞噬能力下降（圖3F）。說明VKH衍生的RPE細(xì)胞功能受損，與VKH疾病表型一致，表明構(gòu)建的hiPSC-RPE可作為VKH病的疾病模型，可用于進(jìn)一步的藥物篩選研究。

為了探索VKH疾病的潛在有效研究手段，研究人員利用ChemBridge數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行高通量虛擬篩選。首先，查詢NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得EGR2蛋白序列，通過在線平臺(tái)SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，構(gòu)建EGR2蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖4A）。之后進(jìn)行分子對(duì)接，設(shè)置分子對(duì)接參數(shù)，分析EGR2蛋白活性口袋（對(duì)接位點(diǎn)）位置，篩選最佳潛在小分子結(jié)合位點(diǎn)。

然后以該結(jié)合位點(diǎn)，從ChemBridge網(wǎng)站（https://www.abmole.cn/chembridge-screening-libraries.html）上選擇并下載ChemBridge數(shù)據(jù)庫(kù)中的139萬種化合物，進(jìn)行高通量虛擬篩選（HTVS），得到417000個(gè)苗頭化合物（hit）。之后用SP模式從前30%的化合物中重新篩選得到200個(gè)化合物，再根據(jù)結(jié)合方式、成藥性和可利用篩選得到最佳的50種化合物。

最后，根據(jù)Lipinski規(guī)則選擇了最后三種先導(dǎo)小分子化合物CQMU98（Z436179998）、CQMU20（Z440170920）和CQMU72（Z440457672）。購(gòu)買三種化合物后通過前面構(gòu)建的細(xì)胞模型做進(jìn)一步的功能評(píng)價(jià)。

為了驗(yàn)證篩選到的小分子化合物對(duì)RPE功能的影響，對(duì)構(gòu)建的hiPSC-RPE細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過RT-qPCR、Western blotting、免疫熒光、TEER檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CQMU98可以顯著提高h(yuǎn)iPSC-RPE細(xì)胞中EGR2和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表達(dá)，并增加RPE細(xì)胞的TEER值和吞噬FITC-葡聚糖的能力（圖5）。表明CQMU98能夠逆轉(zhuǎn)hiPSC-RPE細(xì)胞受損表型，恢復(fù)RPE的屏障和吞噬功能。

本研究利用ChemBridge結(jié)構(gòu)多樣的化合物數(shù)據(jù)獲得針對(duì)難治疾病的重要候選化合物，體現(xiàn)了ChemBridge化合物卓越的生物活性。AbMole是ChemBridge在中國(guó)唯一官方指定合作伙伴。

鳴謝：Wanqian Li, et al. Clin Immunol. 2023 Jan;246:109205.