因細菌和真菌感染，器官產(chǎn)生的免疫細胞積累被稱為肉芽腫。肉芽腫有助于控制感染，但也會引起疾病。最近的研究表明，免疫細胞和結(jié)構(gòu)細胞之間的相互作用網(wǎng)絡有助于維持肉芽腫，但肉芽腫的形成的分子和細胞過程尚不清楚。

2023年2月，奧地利科學院分子醫(yī)學研究中心的Krausgruber團隊在Immunity?（IF 43.474）雜志上發(fā)表題為“Single-cell and spatial transcriptomics reveal aberrant lymphoid developmental programs driving granuloma formation”的研究，通過對12名持續(xù)性皮膚結(jié)節(jié)病患者的配對樣本，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合的方式，對肉芽腫的分子和細胞結(jié)構(gòu)進行分析，確定了肉芽腫與淋巴器官發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄進程，探究了個體和器官之間共享的肉芽腫病理機制，為治療干預肉芽腫提供了潛在的靶點。

?研究材料

持續(xù)性皮膚結(jié)節(jié)病患者的病變皮膚和非病變皮膚，n=12

?技術(shù)路線

步驟1：單細胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組分析皮膚肉芽腫的細胞類型；

步驟2：細胞表達譜構(gòu)建及關(guān)鍵免疫細胞類型鎖定；

步驟3：巨噬細胞的亞聚類及肉芽腫相關(guān)巨噬細胞的定位;

步驟4：T細胞的多重亞聚類及關(guān)鍵免疫特征；

步驟5：成纖維細胞的亞聚類及免疫表達分析；

步驟6：細胞互作分析及免疫熒光驗證;

步驟7：三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）特征分析及小鼠模型驗證。

?研究結(jié)果

1. 巨噬細胞、T 細胞和成纖維細胞是皮膚肉芽腫的主要細胞類型

作者對12名持續(xù)性皮膚結(jié)節(jié)病患者的病變和非病變皮膚的配對活檢組織進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，共得到56000個單細胞，并鑒定到淋巴細胞、骨髓細胞、角質(zhì)形成細胞、肥大細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、周細胞和黑色素細胞8個細胞類型。接下來，對12名患者的皮膚活檢組織進行了空間轉(zhuǎn)錄組學和免疫熒光蛋白染色。單細胞數(shù)據(jù)可通過反卷積映射在空間轉(zhuǎn)錄組的分布上。免疫熒光蛋白染色將CD3+ T細胞，CD68+巨噬細胞和CD90+成纖維細胞鑒定為肉芽腫內(nèi)的主要細胞類型。總之，這些單細胞和空間圖譜使我們能夠使用綜合生物信息學方法系統(tǒng)地研究結(jié)節(jié)病肉芽腫中的主要細胞類型及其相互作用。

2. 特定的巨噬細胞、T細胞和成纖維細胞亞群在肉芽腫中積累

作者根據(jù)轉(zhuǎn)錄相似性聚類了20個細胞簇，并根據(jù)標記基因的表達進行細胞定義。在病變和非病變皮膚中觀察到7個非免疫細胞簇（主要是結(jié)構(gòu)細胞）和13個免疫細胞簇。結(jié)構(gòu)細胞包括血液內(nèi)皮細胞，淋巴內(nèi)皮細胞，成纖維細胞等；免疫細胞包括樹突狀細胞，細胞毒性T細胞，輔助性T細胞，調(diào)節(jié)性T細胞，自然殺傷細胞，B細胞，巨噬細胞和肥大細胞。來自簇0（病變巨噬細胞）、簇1（病變輔助性T細胞）和簇9（病變成纖維細胞）的細胞幾乎只存在于病變皮膚中。相比之下，內(nèi)皮細胞，上皮細胞，黑色素細胞，肥大細胞，樹突狀細胞和某些淋巴細胞亞群沒有這種分布差異。

作者對空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行了UMAP降維和無監(jiān)督聚類，產(chǎn)生了四個簇。簇0、1和2在所有樣本中均存在，而簇3僅存在于包含血管組織的樣本，主要是平滑肌細胞。作者在組織學上將這些簇注釋為肉芽腫性真皮（簇0）、未受影響的真皮（簇1）和表皮（簇2）。細胞反卷積顯示，巨噬細胞、輔助性T細胞和成纖維細胞的病變亞群主要存在于肉芽腫性真皮（簇0）中，而非病變亞群存在于未受影響的病變組織（簇1）中。作者進一步將皮膚肉芽腫的數(shù)據(jù)與已發(fā)表的肺肉芽腫、眼眶脂肪組織、淚腺組織和進行性纖維化肺肉芽腫組織的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)進行了比較，這些肉芽腫的基因特征在病變皮膚中始終富集，表明肉芽腫形成的某些調(diào)節(jié)途徑在器官之間共享。

3. ?GA巨噬細胞顯示出強烈的促炎特征

作者對所有巨噬細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組譜進行了降維和無監(jiān)督聚類，產(chǎn)生了兩個主要的亞群。簇0（含兩個巨噬細胞亞群）中的細胞來自病變皮膚，而簇1（骨髓細胞）中的細胞主要來自非病變皮膚。CD14，F(xiàn)CGR3A（編碼CD16）和APOC1的mRNA表達較高，與白細胞介素-1相關(guān)的基因水平降低。因此，作者將簇0相關(guān)的骨髓細胞定義為“肉芽腫相關(guān)（GA）巨噬細胞”，將簇1的細胞稱為“穩(wěn)態(tài)巨噬細胞”。

?GA巨噬細胞顯示ACE（結(jié)節(jié)病血清標志物），CHI3L1，CHIT1，CYP27A1和CYP27B1的高mRNA表達，GA巨噬細胞也表達S100A8和S100A9水平升高（編碼鈣衛(wèi)蛋白）。此外，GA巨噬細胞高度表達IFNGR1，并顯示出與IFN-g激活的巨噬細胞相關(guān)的基因上調(diào)（CCL5，CXCL9，CXCL10等基因），細胞裂解和溶酶體（LAMP2和LYZ）以及ECM組分（FN1，OSM和SPP1）的基因上調(diào)。

為了進一步表征GA巨噬細胞，作者重新聚集了所有巨噬細胞并確定了兩個病變亞簇：GA巨噬細胞簇GA0和GA1。作者在簇GA0中檢測到幾種結(jié)節(jié)病相關(guān)基因（ACE，CHI3L1，CHIT1，CYP27A1和CYP27B1）的更高表達，并且將GA0巨噬細胞基因標記專門定位于結(jié)節(jié)病肉芽腫。簇GA0中金屬蛋白酶（MMP9，MMP12和MMP14）的表達增加，相同的基因在簇GA1中下調(diào)。這些結(jié)果表明，GA1和GA0巨噬細胞在調(diào)節(jié)肉芽腫內(nèi)免疫細胞運輸和維持的能力方面存在功能異質(zhì)性。GA0巨噬細胞還表達CSF1基因，該基因編碼巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），是巨噬細胞存活、分化和增殖的重要因子。綜上，肉芽腫內(nèi)部存在由GA巨噬細胞塑造的高度炎癥環(huán)境。這些巨噬細胞支持適應性免疫反應和ECM重塑，從而有助于肉芽腫持續(xù)炎癥的微環(huán)境。

4.??具有Th17.1表型的T細胞富含肉芽腫

數(shù)據(jù)鑒定了七個淋巴細胞簇，包括輔助性T細胞（簇0，1和6），調(diào)節(jié)性T細胞（簇2），細胞毒性CD8 T細胞（簇3）和NK細胞（簇5）。簇4的T細胞表現(xiàn)出具有輔助性T細胞和細胞毒性T細胞特征（CD3、CD4、CD8和GZMK）的混合表型，稱它們?yōu)槠渌鸗細胞。簇 0 的輔助T細胞由病變和非病變皮膚細胞組成，而簇1的細胞主要來源于病變皮膚（圖 4A）。因此，作者將簇0命名為穩(wěn)態(tài)輔助性T細胞，將簇1命名為GA輔助性T細胞。這些觀察結(jié)果表明，肉芽腫包含多種T細胞亞群，GA輔助性T細胞構(gòu)成肉芽腫特異性細胞亞群。通過基因表達分析（趨化因子、細胞因子、淋巴毒素相關(guān)基因）和基因集富集分析（IFN-g 信號傳導、糖酵解、TCR信號傳導上調(diào)，細胞自噬、細胞遷移皮質(zhì)類固醇反應下調(diào)），GA輔助性T細胞存在Th17.1細胞特征，轉(zhuǎn)錄因子T-bet（由TBX21編碼）和Rorγt（由RORC編碼）在GA輔助性T細胞和肉芽腫性皮膚中共同表達。Th17.1細胞通過CCL20-CCR6軸募集到炎癥部位，其中CCL20由骨髓細胞產(chǎn)生，其受體CCR6在T細胞上表達。免疫熒光蛋白染色在位于肉芽腫內(nèi)的CD3+ T細胞上檢測到CCR6表達。綜上，肉芽腫內(nèi)的持續(xù)刺激導致輔助T細胞向促進巨噬細胞活化和炎癥反應的Th17.1細胞分化。

5. ?結(jié)構(gòu)細胞促進肉芽腫的局部炎癥和組織重塑

與巨噬細胞或T細胞相比，病變和非病變皮膚之間的內(nèi)皮細胞在轉(zhuǎn)錄表達上更相近。在成纖維細胞中，作者確定了三個簇。根據(jù)細胞來源，聚類0稱為“穩(wěn)態(tài)成纖維細胞”，將聚類1稱為“GA成纖維細胞”，而聚類2是“其他成纖維細胞”。在GA成纖維細胞中，觀察到OSMR表達更高，該基因促進促炎因子FAP，PDPN和THY1的表達，這些因子也在從慢性發(fā)炎組織中分離的成纖維細胞中表達?？傮w而言，作者觀察到GA成纖維細胞中的細胞異質(zhì)性高于穩(wěn)態(tài)成纖維細胞，部分原因是GA成纖維細胞中存在兩個不同的亞群。根據(jù)基因表達得知，“免疫相互作用成纖維細胞”表達參與細胞募集和保留，巨噬細胞吸引和活化，抗原呈遞；“組織重塑成纖維細胞”編碼ECM成分的基因、以及ECM和血管生成調(diào)節(jié)因子，并影響細胞遷移，腫瘤侵襲和增殖。

?在病變皮膚中，位于肉芽腫附近的 GA 成纖維細胞顯示出促炎標記物FAP的高 mRNA 表達。ECM 成分分泌在肉芽腫內(nèi)部發(fā)炎結(jié)構(gòu)中，基質(zhì)沉積和降解的動態(tài)平衡可能促進淋巴細胞運輸，同時增強免疫細胞在肉芽腫內(nèi)的粘附和保留。將GA成纖維細胞與穩(wěn)態(tài)成纖維細胞進行了比較，GA成纖維細胞的特征在于免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，包括IRF8，RELB和STAT2。以及免疫相互作用（HOXC9，NR2F2和TBX15）和IFN反應（IRF3，IRF5，IRF8等基因）的富集。總之，兩種GA成纖維細胞參與免疫細胞吸引、激活和保留，有助于肉芽腫形狀和結(jié)構(gòu)的組織重塑。

6. ?免疫細胞和結(jié)構(gòu)細胞的細胞交流定義了肉芽腫結(jié)構(gòu)

基于各細胞類型間的受配體分析，GA 巨噬細胞、T 細胞和成纖維細胞表達多種趨化因子和趨化因子受體，它們可預測細胞間相互作用。幾種炎癥相關(guān)相互作用的基因顯著富集在空間轉(zhuǎn)錄組的肉芽腫數(shù)據(jù)中。GA 輔助T細胞表達 IFNG，其作用于表達IFNGR1的巨噬細胞和結(jié)構(gòu)細胞；GA輔助T細胞也表達 LTB，而相應的受體LTBR在巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中表達。PECAM1（編碼CD31）在內(nèi)皮細胞中表達，與肉芽腫內(nèi)表達CD38的GA巨噬細胞和GA輔助T細胞的相互作用，并且這種相互作用通過免疫熒光蛋白染色得到證實。各種集成素在成纖維細胞（CD44、ITGA9），T細胞（ITGA4、CD49d）和內(nèi)皮細胞（ITGAV、ITGA5和ITGA9）中表達，它們介導ECM組分基因（FN1、SPP1和TNC）和膠原蛋白。

?另外，作者觀察到幾種免疫調(diào)節(jié)機制的顯著富集。GA成纖維細胞和GA輔助T細胞中DPP4高表達；其次，免疫調(diào)節(jié)基因CTLA4在T細胞中高表達，其相互作用基因CD80和CD86在肉芽腫結(jié)構(gòu)內(nèi)的 GA 巨噬細胞上表達；第三，在肉芽腫內(nèi)觀察到PDCD1（編碼免疫檢查點受體 PD-1）和CD274（編碼相應配體 PD-L1）的高表達。最后，IL23和IL23R在肉芽腫中也高度表達，可能有助于創(chuàng)造利于Th17.1細胞表型的細胞環(huán)境。

7. ?肉芽腫與三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）共享關(guān)鍵特征

研究數(shù)據(jù)揭示了肉芽腫和三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）之間的相似之處，TLS是非淋巴組織中的淋巴聚集體，在腫瘤或感染部位附近形成并有助于有效的免疫反應。數(shù)據(jù)顯示，12種趨化因子驗證了肉芽腫和TLS之間的全局轉(zhuǎn)錄表達相似性，并在肉芽腫中高表達：CCL5、CXCL9 和CXCL10在GA巨噬細胞中上調(diào)，CCL4和CCL5在GA T細胞中上調(diào)，CCL5、CCL19、CXCL9、CXCL10以及 CXCL11在GA成纖維細胞中上調(diào)。因此，肉芽腫形成構(gòu)成了淋巴器官的失調(diào)和異常形式。

將肺肉芽腫、眼眶脂肪組織、淚腺組織和進行性纖維化肺肉芽腫組織的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)與皮膚肉芽腫的scRNA-seq數(shù)據(jù)進行比較分析，多種調(diào)節(jié)基因進行跨組織類型的表達：CXCR4、HLA-DRB1、HLADQA1、JUNB、LYZ、PARP14、SOCS3、SOD2和TYMP。且同樣參與Th17.1細胞信號、巨噬細胞激活、TLS形成和和 ECM重塑。

作者為驗證上述結(jié)果，使用肉芽腫形成小鼠模型在藥理學上用藥物FPA-014（靶向作用于基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP12）處理。與對照治療相比，用MMP12抑制劑FPA-014治療小鼠4周后，肉芽腫誘導的四肢和尾部皮膚腫脹顯著減少。這些結(jié)果支持基質(zhì)金屬蛋白酶在肉芽腫形成和維持中的功能性貢獻，可能是由基質(zhì)金屬蛋白酶作為ECM調(diào)節(jié)劑和免疫細胞激活劑而介導的。

?小編小結(jié)

本研究采用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序+空間轉(zhuǎn)錄組測序的時空組學聯(lián)合模式，對肉芽腫組織中免疫細胞類型進行探究。通過聯(lián)合分析其他組織中肉芽腫的bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合小鼠驗證實驗，證明肉芽腫相關(guān)巨噬細胞、輔助T細胞和成纖維細胞發(fā)生密切的細胞交流，并形成異常的TLS。肉芽腫轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)進程由三個關(guān)鍵過程驅(qū)動：免疫代謝的變化，細胞因子和趨化因子途徑的改變以及集成素和ECM的調(diào)節(jié)。作者的分析創(chuàng)建了非感染性肉芽腫的綜合分子和空間景觀，并為肉芽腫形成背后的生物學過程的治療靶向提供了豐富的數(shù)據(jù)支撐。

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