我相信，同為科研淪落人的你，一定知道只要做了基因編輯細(xì)胞株的構(gòu)建，無論是細(xì)胞敲除、敲入，還是點(diǎn)突變、穩(wěn)轉(zhuǎn)株，都難以逃脫要檢測細(xì)胞表型的命運(yùn)。畢竟你構(gòu)建的細(xì)胞系連想要的表型都沒有，是很難有底氣投高分文章的。 只是，這么多種細(xì)胞表型，哪些表型服務(wù)檢測搭配在一起會(huì)更好？做細(xì)胞凋亡檢測是不是也要檢測細(xì)胞周期？每種細(xì)胞表型都有幾種檢測方法，要選哪個(gè)？

先別急，大部分細(xì)胞（尤其是腫瘤細(xì)胞）表型研究都離不開細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移/侵襲和細(xì)胞凋亡這幾種表型分析，把這幾種表型分析的原理和用途弄明白也許就知道答案了！

1、細(xì)胞增殖

細(xì)胞增殖（cell proliferation）是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)。 通過對比不同細(xì)胞組別的生長曲線，比如野生型VS突變體、對照VS過表達(dá)、對照VS敲降等等來判斷所構(gòu)建的細(xì)胞系的增殖狀態(tài)是否有顯著差異，進(jìn)而可以選擇進(jìn)行細(xì)胞周期或細(xì)胞凋亡的檢測，如圖1呈現(xiàn)的是過表達(dá)p62對U87和U251細(xì)胞系增殖的影響。

檢測細(xì)胞增殖的方法有很多，其中常用的是CCK-8檢測法和活細(xì)胞計(jì)數(shù)法。計(jì)數(shù)法不必多說，科研人必備技能，而CCK-8檢測法是利用正常細(xì)胞的線粒體內(nèi)含有的琥珀酸脫氫酶可將四唑鹽類物質(zhì)還原為紫色結(jié)晶狀物質(zhì)的原理，當(dāng)這些紫色物質(zhì)沉積在細(xì)胞周圍，可以通過酶標(biāo)儀讀取450nm OD值（optical density），從而檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)。其他方法如BrdU染色法和Ki-67檢測法，可以反映出增殖細(xì)胞的空間分布，但只能捕獲單一時(shí)間點(diǎn)的增殖細(xì)胞比例，因此一般用于檢測組織切片的細(xì)胞增殖。

2、細(xì)胞周期

通常，在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖有差異后，可以通過檢測細(xì)胞周期來找出產(chǎn)生差異的原因，比如S、G2和/或M期的細(xì)胞減少，而大多數(shù)細(xì)胞停滯在G1期，那就說明可能是G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)出現(xiàn)了異常，這對研究深入了解生物的生長發(fā)育和控制腫瘤生長等有重要意義。細(xì)胞周期的檢測方法是簡便直觀的碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色-流式分析法。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比，因此可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測定，由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，根據(jù)DNA含量的分布情況，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期、S期和G2/M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率（圖2），進(jìn)而分析細(xì)胞周期是否正常。

3、細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、抑癌基因P53等。凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，如腫瘤和自身免疫性疾病等，因此如果你是研究腫瘤或退行性疾病，細(xì)胞凋亡的檢測往往是必要的，因?yàn)檫@一指標(biāo)將會(huì)成為后續(xù)機(jī)制研究的風(fēng)向標(biāo)。

由于細(xì)胞凋亡的過程有典型的形態(tài)和分子層面的變化，檢測方法也是多樣的，常用的有Annexin V/PI雙染法、TUNEL檢測法和Caspase-3活性檢測法。其中，Annexin V/PI雙染法因其可區(qū)分凋亡早期和晚期和方便量化而被廣泛使用。磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine,PS)在細(xì)胞凋亡的早期，會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V能與PS高親和力特異性結(jié)合，把綠色熒光分子FITC連接到Annexin-V即可標(biāo)志內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)的凋亡小體。而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，PI可進(jìn)入細(xì)胞結(jié)合DNA并發(fā)出熒光。因此通過流式分析Annexin-V-FITC和PI的信號分布便可區(qū)分凋亡早期（Annexin-V-FITC陽性+PI陰性）和晚期（Annexin-V-FITC陽性+PI陽性）的細(xì)胞（圖3）。

4、細(xì)胞毒性

在研究疾病的細(xì)胞模型中，你或許希望在過表達(dá)、敲降或敲除潛在藥物靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，高通量篩選藥物分子庫，從而鑒定出潛在的治療藥物，又或者是需要進(jìn)行特定物質(zhì)細(xì)胞毒性的檢測，比如藥物篩選，那你可以通過細(xì)胞毒性檢測來篩選敏感化合物，或者篩選不同細(xì)胞系對某一化合物多個(gè)濃度的敏感性。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性檢測的方法有很多種，其中基于細(xì)胞代謝活性的CCK-8和ATP檢測法指示的是細(xì)胞活力（圖4），而基于代謝酶泄漏的LDH檢測法指示的則是細(xì)胞損傷程度（圖5），具體可以根據(jù)自身的研究需求來選擇。

5、細(xì)胞遷移、侵襲

在腫瘤治療中，普遍認(rèn)為抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是有效的治療手段。因此在對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)（過表達(dá)、敲降、敲除、點(diǎn)突變、藥物處理）后對細(xì)胞的遷移與侵襲能力進(jìn)行檢測，可以作為評估干預(yù)效果的一個(gè)有效指標(biāo)。

檢測細(xì)胞遷移能力和侵襲能力常用的實(shí)驗(yàn)手段是Transwell實(shí)驗(yàn)（圖6）。Transwell顧名思義是“穿孔實(shí)驗(yàn)”，即將小室放在加入完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，小室中含有密密麻麻的小孔，將細(xì)胞懸液加到小室中，細(xì)胞可通過形變穿過小室中的孔而跑到營養(yǎng)更豐富的小室外部并貼在外側(cè)，最后通過對小室外部的細(xì)胞進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，就可以判斷細(xì)胞的遷移與侵襲能力的強(qiáng)弱。不過檢測遷移和侵襲的實(shí)驗(yàn)方法還是存在差異，侵襲檢測需在聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠，用以模仿細(xì)胞外基質(zhì)。

說到這里，也許你會(huì)發(fā)現(xiàn)有時(shí)候并不是只檢測某一項(xiàng)表型就能夠得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論了，而是好幾項(xiàng)一起檢測，還要結(jié)合檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，才能得出最終結(jié)論。什么？你問我要做3、4種怎么辦？從細(xì)胞增殖到細(xì)胞周期再到細(xì)胞遷移/侵襲？實(shí)驗(yàn)分組還特別多？

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