背景介紹

Cre 重組酶(Cyclization Recombination Enzyme, 即環(huán)化重組酶)，是細(xì)菌噬菌體P1的I型拓?fù)洚悩?gòu)酶。其基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp，為38kDa大小的、由343個(gè)氨基酸組成的多肽單體蛋白。Cre重組酶的C-末端結(jié)構(gòu)域包含催化活性位點(diǎn)，能夠催化DNA分子中特定位點(diǎn)之間的重組。而且與限制酶相似，能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。

LoxP序列??locus of X (cross)-over in P1)，是位于P1噬菌體中長(zhǎng)度為34bp的一段序列，由兩個(gè)13bp的反向回文序列和8bp的中間間隔序列共同組成，反向回文序列是Cre重組酶的識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，間隔序列決定LoxP序列的方向。loxP有多種突變類型，多種突變類型之間不交叉識(shí)別。

Cre-loxP系統(tǒng)基因重組原理

一般而言，當(dāng)細(xì)胞基因組內(nèi)存在兩個(gè)LoxP位點(diǎn)時(shí)，Cre重組酶會(huì)誘導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列發(fā)生重組。

Cre重組酶介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過程，重組的結(jié)果取決于兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向，主要有以下情況：

01

刪除（Deletion）

如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列

02

倒轉(zhuǎn)（Inversion）

如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列倒轉(zhuǎn)

03

易位（Translocation）

如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位，即基因轉(zhuǎn)座

04

序列互換(Cassette exchange)

如果四個(gè)loxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)loxP間的序列互換(cassette exchange)

兩種策略實(shí)現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)

01

DIO序列策略

DIO序列策略的關(guān)鍵在于引入兩對(duì)不同的lox位點(diǎn)：LoxP和Lox2272。在Cre酶的作用下，不論是識(shí)別LoxP還是Lox2272位點(diǎn)，第一步都可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的反轉(zhuǎn)。反轉(zhuǎn)會(huì)使兩個(gè)loxP位點(diǎn)或者Lox2272位點(diǎn)變成同向。第二步在Cre酶的作用下，剪切刪除一個(gè)LoxP位點(diǎn)和一個(gè)Lox2272位點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達(dá)。

02

LSL序列策略

LSL序列策略是將LoxP和轉(zhuǎn)錄中止盒插入啟動(dòng)子和目的基因中間，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄“終止盒”(Lox-stop-Lox)，這個(gè)“終止盒”能夠終止基因的轉(zhuǎn)錄。在沒有Cre酶的作用下，轉(zhuǎn)錄終止盒下游靶基因完全不表達(dá)。但是如果細(xì)胞中有Cre酶，終止盒會(huì)被Cre酶切除，從而實(shí)現(xiàn)組織特異性的基因過表達(dá)。

Cre/loxP條件性重組改造

經(jīng)過現(xiàn)代基因工程方法對(duì)Cre和LoxP元件的改造，Cre-LoxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了更加豐富的條件性重組策略。

01

對(duì)Cre元件的改造

提高Cre重組酶活性；構(gòu)建可誘導(dǎo)的方式

02

對(duì)loxP元件的改造

對(duì)間隔區(qū)和回文序列進(jìn)行突變，突變后的序列依然能被Cre重組酶識(shí)別和重組，但是突變的loxP序列必須和同樣突變的loxP序列匹配介導(dǎo)基因重組，在同一Cre重組酶的作用下，可以實(shí)現(xiàn)多序列的基因重組，產(chǎn)生非常多元的重組結(jié)果。下表為常見的loxP類型：

Cre-loxP系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)

01

高效性

Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA片段形成復(fù)合物之后，可以提供足夠的能力引發(fā)之后的DNA重組過程，重組過程簡(jiǎn)約高效；重組不受切除片段長(zhǎng)短及位置影響，可以在活體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，可隨細(xì)胞分裂和動(dòng)物傳代穩(wěn)定遺傳。

02

特異性強(qiáng)

loxP位點(diǎn)是一段含回文序列結(jié)構(gòu)和中間有間隔的34bp元件，這種結(jié)構(gòu)保證了loxP序列的唯一性，從而保證基因重組的特異性很強(qiáng)；在動(dòng)物模型中至今未發(fā)現(xiàn)Loxp位點(diǎn)之外的非特異性重組，只在體外實(shí)驗(yàn)中有少量報(bào)道。

03

應(yīng)用范圍廣

Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可以在生物體不同的組織、不同的生理?xiàng)l件下發(fā)揮作用，所以說Cre-loxP系統(tǒng)的可應(yīng)用范圍非常廣。

04

快速性

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)在受精卵分裂前的短時(shí)間內(nèi)，Cre介導(dǎo)的特異性重組便會(huì)完成。

05

時(shí)空特異性

如果將Cre結(jié)構(gòu)基因置于某一特定啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)基因控制之下，便會(huì)實(shí)現(xiàn)Cre酶蛋白在特定組織和特定時(shí)間的可控型表達(dá)，繼而限定了重組發(fā)生的時(shí)空性。①細(xì)胞類型特異啟動(dòng)子：aP2(脂防組織)、AQP2(腎臟集合管)、lck(胸腺細(xì)胞)、alphaA(眼晶狀體)等；②外源性化學(xué)物質(zhì)調(diào)控啟動(dòng)子：干擾素反應(yīng)Mxl啟動(dòng)子、他莫西酚依賴的雌激素突變體啟動(dòng)子。

Cre-LoxP重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

由于Cre/LoxP重組系統(tǒng)高效簡(jiǎn)單的作用方式，它已在基因定點(diǎn)刪除、外源基因定點(diǎn)整合、疾病動(dòng)物模型建立、篩選高效表達(dá)基因座等方面得到了有效利用，成為體內(nèi)外DNA重組的有力工具。

病毒依賴的基因重組的優(yōu)勢(shì)

01

更強(qiáng)的區(qū)域特異性

由于病毒可以通過局部注射的方式保證區(qū)域特異性感染，再加上驅(qū)動(dòng)Cre基因的特異性啟動(dòng)子，能夠?qū)崿F(xiàn)更強(qiáng)的區(qū)域和細(xì)胞特異性的基因重組。

02

更少的花費(fèi)

購(gòu)買轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的費(fèi)用一般是比較昂貴的，而且轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的飼養(yǎng)、基因型鑒定都需要不少的人力、物力，而病毒的制備、保存和注射所花的費(fèi)用相對(duì)來說是比較少的。

03

更短的實(shí)驗(yàn)周期

由于病毒能非常迅速的起作用，而轉(zhuǎn)基因小鼠的交配過程特別耗時(shí)間，因此采用注射病毒到轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的方式，可以大量縮短實(shí)驗(yàn)周期。

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