如何選擇正確的方法進(jìn)行細(xì)胞的支原體檢測(cè)？支原體的檢測(cè)方法有哪些？目前實(shí)驗(yàn)室常用的支原體檢測(cè)方法有培養(yǎng)法、熒光指示細(xì)胞法、PCR 法、掃描電子顯微鏡法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)具體情況，選擇不同的方法，或幾種方法聯(lián)合使用。

一、培養(yǎng)法

培養(yǎng)法為最為經(jīng)濟(jì)可靠的方法，但其實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，所以常用來進(jìn)行對(duì)懷疑細(xì)胞的最后甄別。常用于細(xì)胞及臨床治療細(xì)胞的支原體檢查。

（一）材料與設(shè)備

1. 精氨酸肉湯培養(yǎng)基 — 按說明稱量粉劑，蒸餾水配制， 高壓除菌（加20％胎牛血清）。

2. 支原體瓊脂培養(yǎng)基?—?按說明稱量粉劑，蒸餾水配制，高壓除菌（加20％胎牛血清）。

3. 其他?? 超凈工作臺(tái)、無菌吸管、試管架、培養(yǎng)試管／皿、37°C 培養(yǎng)箱。

（二）操作步驟

1. 樣品的儲(chǔ)存。樣品取材后，最好盡快進(jìn)行檢測(cè)。樣品如在24h 以內(nèi)進(jìn)行支原體檢測(cè)， 可儲(chǔ)存在2~8℃; 如果超過24h 樣品應(yīng)放置于－20℃ 以下保存。-20℃保存的樣品，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需重新加入到對(duì)照培養(yǎng)細(xì)胞中，培養(yǎng)72h 后，取上清直接進(jìn)行接種檢測(cè)。

2. 準(zhǔn)備精氨酸肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基（半流體）。

3. 將樣品分別接種到10ml 精氨酸肉湯培養(yǎng)基、半流體培養(yǎng)基中（已冷卻至36℃） ，每支培養(yǎng)基接種樣品0.5~ 1.0ml. 每種樣品接種6 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基，3 支半流體培養(yǎng)基。

4. 接種6d 后，取3 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基中樣品0.5 ~ 1.0ml. 復(fù)種于精氨酸肉湯培養(yǎng)基中。

5. 36 ℃ 培養(yǎng)29d, 每隔3d 觀察一次。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（三）結(jié)果判斷

培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，精氨酸肉湯培養(yǎng)基如有支原體生長(zhǎng)，則液體顏色改變（粉色或黃色) 。

半流體培養(yǎng)基中如有支原體生長(zhǎng)，則出現(xiàn)絮狀沉淀

二、熒光指示細(xì)胞法?

熒光指示細(xì)胞法較為快捷，方法簡(jiǎn)單，但其靈敏度有一定的欠缺， 易造成漏檢。

常見的支原體檢測(cè)方法中最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的方法是熒光指示細(xì)胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿，其激發(fā)波長(zhǎng)為350nm（紫外激發(fā)），發(fā)射波長(zhǎng)為420nm。該染料會(huì)結(jié)合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(shù)(55%~80%），所以可被染色而檢測(cè)到。支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體DNA, 證明該細(xì)胞有支原體污染。

（一）材料與設(shè)備

1. 熒光顯微鏡。

2. CO2?培養(yǎng)箱。

3. 無菌小爬片。

4.?無菌培養(yǎng)皿。

5. 不含抗生素的完全培養(yǎng)液。

6. 二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中，在室溫下用磁力攪拌30~40min, 使完全溶解，－20℃ 避光保存。

7. 二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述濃縮液，加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中，終濃度為0.5μg/ml 。

8. 固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液為細(xì)胞固定液。

9. 封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混勻，調(diào)pH 至5.5 。

10.不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液或PBS。經(jīng)多種方法檢測(cè)確定為支原體陰性的VERO 細(xì)胞。

（二）操作步驟

1. 無菌收集待測(cè)細(xì)胞上清：懸浮細(xì)胞離心后取上清液。

2. VERO 細(xì)胞爬片：將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加VERO 細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度約3×104 個(gè)/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h 使其貼壁。

3. 制備標(biāo)本。向6 孔板內(nèi)滴加待檢細(xì)胞上清液約1ml, 注意設(shè)立對(duì)照組（已證實(shí)的支原體陽性和陰性細(xì)胞上清液），培養(yǎng)48h 后( VERO 細(xì)胞匯合前）將細(xì)胞爬片從平皿中取出。

4. 漂洗—將細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)皿中，用不含酚紅、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS) 漂洗3次。

5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

6. 漂洗—待固定液自然風(fēng)干后用去離子水漂洗3 次。

7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次，每次1 ~2min 。

9. 封片，紫外激發(fā)，觀察。

（三）結(jié)果判斷

當(dāng)陰性及陽性對(duì)照結(jié)果均成立時(shí)，結(jié)果有效 。

1. 陰性結(jié)果?僅見待檢細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。

2. 陽性結(jié)果?熒光顯微鏡下細(xì)胞周圍或細(xì)胞膜表面可見大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)。

（四）小結(jié)

1. 嚴(yán)格配制工作液及封片液。

2. 保證作為指示細(xì)胞的VERO 細(xì)胞沒有被支原體污染。

3. 必須同時(shí)設(shè)立陽性及陰性對(duì)照， 注意重復(fù)，以排除假陽性和假陰性結(jié)果。

4. 應(yīng)全面觀察爬片，并注意可疑陽性的熒光點(diǎn)是凋亡小體還是支原體污染。

5. 可適當(dāng)調(diào)整熒光染料的工作濃度和染色時(shí)間，避免出現(xiàn)非特異性染色，如胞漿著色。

三、PCR 法??

PCR 法檢測(cè)支原體的方法最為快速、靈敏、取樣量少，既可做細(xì)胞本身，也可做細(xì)胞上清的檢測(cè)，同時(shí)可以檢測(cè)多種支原體的污染，是目前常用的檢測(cè)手段。但其成本較高，條件要求嚴(yán)格，且有時(shí)易出現(xiàn)假陽性或假陰性。彌補(bǔ)的方法是對(duì)懷疑的樣品要經(jīng)過3 次PCR 檢測(cè)，或用培養(yǎng)法檢測(cè)。

PCR 法是20 世紀(jì)80 年代中期建立起來的一種體外DNA 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，其基本原理是酶促DNA 合成反應(yīng)，即在DNA 模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA 聚合酶的作用，使DNA 鏈擴(kuò)增延伸。該實(shí)驗(yàn)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速的特點(diǎn)，但其對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求嚴(yán)格， 實(shí)驗(yàn)成本較高， 有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。

（一）材料與設(shè)備

1.?支原體

2.?PCR 檢測(cè)試劑盒、dNTP?、TaqDNA 聚合酶、緩沖溶液、瓊脂糖、礦物油、超凈工作臺(tái)、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺(tái)式離心機(jī)、旋渦混旋器等。

（二）操作步驟

1. 樣品的收集。待測(cè)細(xì)胞用無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)7d，用無菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待測(cè)。

2. 模板的制作。在無菌的條件下， 取細(xì)胞培養(yǎng)上清1 00μl 于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)，蓋好蓋子， 95 ℃ 水浴加熱5min 。

3. 打開蓋子，向管內(nèi)加StrataClean Resin 10μl，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢， 4℃ 保存。

4. PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系的最適條件為10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，總反應(yīng)體系為50μl ， 反應(yīng)用去離子水均需用紫外燈照射。
??????（1）在0.5ml 塑料離心管中加入35.2μl 去離子水及5μl 10 xTaq 反應(yīng)緩沖溶液。
??????（2）依次加入下列成分：0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
??????（3）加2μl 去離子水，總體積45μl 。
??????（4）加5μl 已制成的模板到反應(yīng)體系中。
??????（5）陽性對(duì)照，內(nèi)對(duì)照各5μl 加入到各自的反應(yīng)體系中。
??????（6）取1支含有以上反應(yīng)體系的離心管，加入5μl 去離子水作為陰性對(duì)照管。
??????（7）在反應(yīng)體系中加入100μl 礦物油。
??????（8）PCR 程序見下表。

5. 瓊脂糖凝膠電泳。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2%。電泳結(jié)束后，凝膠成像分析結(jié)果。

6. 結(jié)果分析。該方法為檢測(cè)支原體的定性方法，在電泳泳道上， Marker、陽性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照均會(huì)出現(xiàn)不同的電泳條帶， 當(dāng)被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶，且位置在陽性對(duì)照和內(nèi)對(duì)照條帶位置之間，即可認(rèn)為該樣品被支原體污染 。

有時(shí)還會(huì)發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條，可能是該樣品感染2 種以上支原體所致。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。

（三）注意事項(xiàng)

PCR 反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行。

注意假陽性、假陰性，有時(shí)需多次重復(fù)。?

四、掃描電子顯微鏡法?

掃描電子顯微鏡法：掃描電子顯微鏡法非常直觀、準(zhǔn)確，對(duì)使用環(huán)境要求高，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，常作為樣品的最后定性檢測(cè)。

（一）原理

利用電子顯微鏡的超級(jí)放大功能， 直接觀察培養(yǎng)細(xì)胞中支原體污染情況。

（二）材料與設(shè)備

待檢測(cè)細(xì)胞，?0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％鋨酸、0.1mol/L磷酸緩沖溶液（ pH7.4 )?，掃描電鏡及相關(guān)設(shè)備。

（ 三）操作步驟

1. 將待檢測(cè)細(xì)胞傳代至貼有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。

2. 37°C , CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h , 取出蓋玻片。

3. 以PBS 洗滌3 次。

4. 以2 .5％戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗滌。

5．以1％鋨酸固定30min, PBS 洗滌。

6. 乙酸異戊酯脫水。

7. CO2 冰點(diǎn)干燥。

8. 噴金。

9 . 掃描電鏡觀察，照相。

（四）結(jié)果分析

支原體感染會(huì)使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎，因此對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)非常重要。一般來說每1至3個(gè)月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測(cè)。將定期支原體檢測(cè)常規(guī)化堅(jiān)持下去，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)支原體感染的關(guān)鍵。

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