前言

還在為如何聯(lián)系單細(xì)胞組學(xué)、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與濕實(shí)驗(yàn)發(fā)愁嗎？近日，海軍軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院及國家肝癌科學(xué)中心分子腫瘤研究室主任蘇長青教授團(tuán)隊(duì)與復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)移研究所所長欽倫秀教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF:13.751）發(fā)表具有多重協(xié)同抗腫瘤機(jī)制的新型溶瘤腺病毒，蘇英晗和黎江博士為該文第一作者，蘇長青教授和欽倫秀教授為通訊作者。歐易生物提供了該項(xiàng)目單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組以及空間轉(zhuǎn)錄組測序和分析相關(guān)工作。

基本信息

材料：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序：2個小鼠腫瘤樣本；空間轉(zhuǎn)錄組測序：4個小鼠腫瘤樣本

期刊：Journal for ImmunoTherapy of Cancer

發(fā)表時(shí)間：2022年5月

方法：10× Genomics scRNA-seq(歐易生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序)、10×Genomics?visium(歐易生物空間轉(zhuǎn)錄組測序)

研究背景和研究目的

溶瘤病毒（Oncolytic virus, OV）是一類具有復(fù)制能力的腫瘤殺傷型病毒，能選擇性感染腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并最終摧毀腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激發(fā)免疫反應(yīng)，吸引更多的免疫細(xì)胞繼續(xù)殺死殘余的腫瘤細(xì)胞。理想情況下，在基因調(diào)控元件的調(diào)控下，改造后的溶瘤病毒在正常細(xì)胞內(nèi)不具有復(fù)制的能力，因而對正常細(xì)胞不會產(chǎn)生影響。目前，溶瘤病毒治療已成為腫瘤免疫治療的一個重要分支。

然而在實(shí)際應(yīng)用中，溶瘤病毒的腫瘤靶向特異性以及破壞腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，遠(yuǎn)沒有達(dá)到人們的期望值。臨床上單獨(dú)應(yīng)用溶瘤病毒治療腫瘤的效果也不理想。如何提高OV產(chǎn)品的安全性和有效性是溶瘤病毒治療面臨的最大挑戰(zhàn)。因此，本文作者旨在設(shè)計(jì)一種新型溶瘤病毒，提高溶瘤病毒的安全性以及靶向腫瘤的有效性。

內(nèi)容概述

作者構(gòu)建了一種新型溶瘤病毒——OncoViron，并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)以及多個實(shí)體瘤細(xì)胞系的移植模型驗(yàn)證其抗癌效果，病毒溶瘤和轉(zhuǎn)基因抗癌活性的協(xié)同作用，以及溶瘤病毒治療與免疫治療結(jié)合治療的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OncoViron的選擇性復(fù)制介導(dǎo)抗癌因子的高表達(dá)，并且能夠特異性靶向多種實(shí)體瘤，顯著抑制癌細(xì)胞增殖。同時(shí)，在免疫缺陷小鼠、免疫健全小鼠和人源化小鼠的多種實(shí)體瘤移植模型上，OncoViron展示出自身以及聯(lián)合PD-1、CAR-T出色的抗癌作用。接下來，作者通過對動物模型的移植瘤進(jìn)行病理表征實(shí)驗(yàn)，以及通過單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組測序分析，進(jìn)一步證實(shí)OncoViron使得被感染腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生巨大轉(zhuǎn)變，OncoViron不僅招募大量淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞核單核巨噬細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment, TME），激活免疫細(xì)胞，尤其是T細(xì)胞的激活，而且誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化，促進(jìn)更多免疫細(xì)胞因子的釋放，從而實(shí)現(xiàn)重塑TME，協(xié)同PD-1、CAR-T進(jìn)行靶向治療。

具體研究內(nèi)容解析

1、OncoViron具有高度的腫瘤選擇性復(fù)制活性并介導(dǎo)抗癌細(xì)胞因子高效表達(dá)

作者設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一款針對廣譜實(shí)體瘤的溶瘤腺病毒OncoViron，其具有在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯兩個層次上精準(zhǔn)控制自身在人類多種實(shí)體瘤癌細(xì)胞中的復(fù)制（圖1A）。伴隨病毒的復(fù)制，其攜帶的抗癌基因也得到了高效表達(dá)（圖1B）。

通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，感染了溶瘤腺病毒OncoViron的細(xì)胞系癌細(xì)胞系HCCLM3、MDA-MB-231、SGC-996，其mRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯改變，差異表達(dá)基因（DEGs）主要富集于細(xì)胞病理生理過程中的局灶性粘附、吞噬體功能、PI3K-Akt、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和MAPK通路（圖1C）。KEGG分析結(jié)果顯示，細(xì)胞功能的變化和信號通路在不同腫瘤細(xì)胞類型中是相似的。

圖1｜OncoViron在腫瘤細(xì)胞系中的選擇性復(fù)制及其抗癌細(xì)胞因子的高效表達(dá)

2、Ad5F11嵌合型Fiber和Ad5H48嵌合型Hexon增強(qiáng)了OncoViron的抗癌功效

柯薩奇-腺病毒受體（Coxsackievirus-adenovirus receptor, CAR）是5型腺病毒(Ad5)的受體。在Ad5基礎(chǔ)上嵌合Ad11型腺病毒的纖毛蛋白（Fiber）形成嵌合型的溶瘤腺病毒，病毒識別的受體轉(zhuǎn)換為CD46分子。流式分析發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中CD46的表達(dá)水平明顯高于CAR（圖2A），因此Ad5F11的嵌合顯著增強(qiáng)了OncoViron在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中的感染能力（圖2B）。

由于Ad5型腺病毒在大多數(shù)人都存在既往感染，體內(nèi)存在中和抗體。為防止OncoViron在治療時(shí)被預(yù)存中和抗體攔截，作者將與Ad48型腺病毒外殼蛋白Hexon與Ad5嵌合，形成嵌合型外殼蛋白Ad5H48。通過將野生型Ad5 (wAd5)注射到BALB/C小鼠尾靜脈，預(yù)免疫48小時(shí)后，再尾靜脈給予嵌合型腺病毒注射，96小時(shí)后取小鼠血液、心臟、肝臟、肺、腎、腦進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過改造的溶瘤腺病毒OncoViron能夠有效避免wAd5預(yù)處理產(chǎn)生的中和抗體的攔截（圖2C），而且肝細(xì)胞對OncoViron的粘附和感染也顯著減少（圖2D）。

圖2｜Ad5F11和Ad5H48嵌合增強(qiáng)OncoViron的功效

3、OncoViron誘導(dǎo)腫瘤選擇性殺傷活性

OncoViron具有靶向癌細(xì)胞進(jìn)行特異性復(fù)制并溶解癌細(xì)胞，而對正常細(xì)胞影響很小。通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)（RealTime Cellular Analysis，RTCA）觀測表明，OncoViron及其對照病毒對各種實(shí)體瘤癌細(xì)胞系均具有依賴于劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的細(xì)胞毒性作用（圖3A）。CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了OncoViron及其對照病毒對多種實(shí)體瘤細(xì)胞具有抑制作用，而對正常細(xì)胞的作用有限，需要極高的感染強(qiáng)度（MOI）才能發(fā)揮一定的殺傷作用 (圖3B)。

圖3｜OncoViron在腫瘤細(xì)胞系中的選擇性殺傷活性

4、OncoViron在動物移植瘤模型中發(fā)揮抗腫瘤活性

OncoViron對多種實(shí)體腫瘤表現(xiàn)出良好的抗癌活性?？偟膩碚f，在實(shí)體瘤裸鼠模型中，OncoViron表達(dá)抗癌細(xì)胞因子，其抗癌效果優(yōu)于空載病毒，并且呈劑量依賴性。在轉(zhuǎn)染人PBMCs的NCG-hILl5人源化小鼠皮下異種移植模型MDA-MB-231中，OncoViron完全抑制腫瘤生長，高劑量組的腫瘤抑制率(Tumor inhibition rate, TIR)達(dá)到97.57%。在CT26和B16腫瘤免疫健全小鼠模型中，OncoViron瘤內(nèi)注射療效是顯著，甚至能在一定程度上抑制未直接治療的對側(cè)移植瘤的生長（圖4A）。

免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)OncoViron處理的裸鼠SGC-996模型腫瘤組織出現(xiàn)大面積壞死，癌細(xì)胞呈E1a、Survivin、hIFN-γ呈陽性，p-AKT下調(diào)（圖4B）。在B16免疫小鼠模型中，腫瘤細(xì)胞感染OncoViron后表達(dá)E1a。與對照組相比，OncoViron治療組TME中CD3+細(xì)胞、CD4+和CD8+ T細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4C）。結(jié)果提示，OncoViron不但能使癌細(xì)胞增殖活性下降，而且浸潤性免疫細(xì)胞數(shù)量增加，說明腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)生了明顯改變。

圖4｜OncoViron及其對照病毒在小鼠移植瘤模型中的抗腫瘤活性

5、OncoViron聯(lián)合免疫治療協(xié)同抑制小鼠移植瘤生長

OncoViron具有協(xié)同增效免疫治療的機(jī)制。在PBMC人源化小鼠皮下異種移植人咽部鱗狀細(xì)胞癌FaDu模型中檢測OncoViron的抗癌活性，低劑量的OncoViron抑瘤效果比PD-1抗體（Keytruda）更好，與Keytruda聯(lián)合使用時(shí)，OncoViron的抑瘤效果明顯增強(qiáng)（圖5A）。在C57-hPD1人源化小鼠結(jié)腸癌MC38移植瘤模型中，檢測OncoViron模擬品Ad5SVPF11H48-mC3（表達(dá)鼠源細(xì)胞因子）聯(lián)合PD-1抗體的療效，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合具有明顯的協(xié)同作用（圖5B）。

對MC38模型對照組(G1組)和Ad5SVPF11H48-mC3聯(lián)合Keytruda組(G4組)的移植瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞測序，根據(jù)經(jīng)典細(xì)胞類型標(biāo)志物，共鑒定出5種細(xì)胞，Top25熱圖顯示兩組腫瘤之間基因表達(dá)譜的變化（圖5C）。使用CNV評價(jià)腫瘤惡性程度，作者發(fā)現(xiàn)，G4組總體CNV水平低于G1組（圖5D）。TME中巨噬細(xì)胞分為5個亞群，其中亞群5在G4組中顯著增加（圖5E）。使用巨噬細(xì)胞極化數(shù)據(jù)集針對巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G4組中的亞群5表現(xiàn)出明顯的M1特征（圖5F）。在G4組中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CCL5，而且還發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞中Lag3表達(dá)顯著下調(diào)（圖5G）。

作者進(jìn)一步針對來自對照組(G1組)、Ad5SVPF11H48-mC3 (G2組)、Keytruda (G3組)、Ad5SVPF11H48-mC3+Keytruda (G4組)的MC38腫瘤進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序分析。在空間層面上，降維聚類得到8個亞群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與G1對照組相比，各治療組亞群2顯著減少，亞群6顯著增加。針對趨化因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)G3和G4組中病毒介導(dǎo)的CCL5高表達(dá)，亞群6中CXCL3和CXCL5均顯著上調(diào)（圖5H,I）。此外，與單細(xì)胞測序結(jié)果一致，空間轉(zhuǎn)錄組測序分析也發(fā)現(xiàn)各處理組CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，尤其是G4組中發(fā)現(xiàn)CD14+單核巨噬細(xì)胞局灶性聚集（圖5J），CD79b+ B細(xì)胞增加，伴隨基質(zhì)中膠原生成減少（圖5K）。促炎/抗炎以及M1/M2極化評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G4樣品促炎活性高，M1極化更明顯（圖5L）。

通過對CD3d+ T細(xì)胞、CD79b+ B細(xì)胞、CD14+單核巨噬細(xì)胞以及CD3d+ T細(xì)胞、CD79b+ B細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞進(jìn)行共定位，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞在OncoViron處理下均明顯增加（圖5M,N）。免疫組化進(jìn)一步分析結(jié)果表明，在OncoViron分布并且表達(dá)mE1a的區(qū)域，腫瘤組織大面積壞死，伴有淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞聚集，形成TME中的三級淋巴樣結(jié)構(gòu)，對腫瘤細(xì)胞具有原位協(xié)同殺傷作用，從而增強(qiáng)免疫治療的療效。

圖5｜OncoViron聯(lián)合PD-1抗體對動物移植瘤模型的協(xié)同抗癌作用

作者除了觀察OncoViron聯(lián)合PD-1治療效果之外，還制備了嵌合抗原受體(CAR-T細(xì)胞)，探究OncoViron聯(lián)合CAR-T的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在NCG小鼠的前列腺癌Du145和乳腺癌MDA-MB-231異種移植模型中，溶瘤腺病毒聯(lián)合CAR-T細(xì)胞治療顯示出腫瘤抑制作用增強(qiáng) (圖6A,B)。在Du145模型中，OncoViron的TIR為80.19% ，OncoViron+CAR - T組的TIR為97.56%)；在MDA-MB-231模型中，溶瘤腺病毒與CAR-T聯(lián)合組也顯示生存期延長 (圖6C)。流式分析證實(shí)， OncoViron表達(dá)的細(xì)胞因子顯著延長了CAR-T的生存時(shí)間，并增加了血液中CAR-T細(xì)胞的數(shù)量 (圖6D,E)。免疫組化顯示，OncoViron+CAR-T組移植瘤組織中，hCD45陽性CAR-T細(xì)胞浸潤數(shù)量增加 (圖6F,G)。研究證實(shí)，OncoViron確實(shí)能夠促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的增殖和浸潤，形成一種協(xié)同機(jī)制，顯著提高治療效果。

圖6｜OncoViron聯(lián)合CAR T對動物異種移植瘤模型的協(xié)同抗癌作用

研究結(jié)論

這篇文章作者研究開發(fā)了一種新型溶瘤病毒——OncoViron，在特異性和有效性方面都取得了顯著提高。OncoViron可以作為一種免疫治療增效劑，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和空間轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，其與免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1聯(lián)合治療能夠顯著改善TME，放大免疫治療的效果。此外，與CAR-T治療聯(lián)合使用也能得到協(xié)同抗癌的效果。以上研究進(jìn)一步拓寬了溶瘤病毒的應(yīng)用范圍。

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