陳教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)調(diào)控精子能量代謝新基因

不孕不育是一種非常普遍的疾病，影響著全球約7000萬(wàn)人的生活。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，目前全世界的育齡夫婦中約有9%在與生育問(wèn)題作斗爭(zhēng)，其中男性因素占約50%。少、弱精癥或畸形精子癥的高發(fā)是男性不育的主要原因，男性精子質(zhì)量呈逐年下降的趨勢(shì)已經(jīng)變成一項(xiàng)世界性的問(wèn)題。

2021年4月20日，清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功課題組在 Cell Reports 在線發(fā)表了題為：SLC22A14 is a mitochondrial riboflavin transporter required for sperm oxidative phosphorylation and male fertility 的研究論文。

該研究揭示了SLC22A14是作為精子細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化，從而維持精子內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)，其表達(dá)缺陷參與雄性不育疾病的發(fā)生。

溶質(zhì)載體（SLC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是人類基因組中第二大膜蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，可以分布在細(xì)胞內(nèi)從核膜到細(xì)胞質(zhì)膜的各種生物膜結(jié)構(gòu)上。SLC 易感位點(diǎn)已被發(fā)現(xiàn)與多種代謝性疾病有強(qiáng)烈相關(guān)性，這些疾病包括胰島素抵抗、2 型糖尿病、高血壓、慢性腎病、痛風(fēng)、哮喘、炎癥性腸病、癌癥、癡呆和焦慮癥等。

SLC22A14是在哺乳動(dòng)物中進(jìn)化保守的SLC22亞家族成員，特異性地表達(dá)在雄性生殖細(xì)胞中。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Slc22a14 基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)雄性純合子敲除小鼠是不育的，然而SLC22A14 的生物學(xué)功能和底物卻完全未知，其致病機(jī)制尚不清楚。

作者首先利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA ）和體外受精試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)了Slc22a14 敲除引發(fā)精子的運(yùn)動(dòng)能力嚴(yán)重受損，致使精子無(wú)法穿透透明帶使卵母細(xì)胞受精。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Slc22a14 敲除精子ATP水平顯著降低，證實(shí)Slc22a14在某種程度上參與了精子的能量代謝。精子的運(yùn)動(dòng)主要依靠鞭毛主段的擺動(dòng)產(chǎn)生助推作用，而鞭毛主段富含糖酵解酶類，因此一直以來(lái)，精子尾部的糖酵解被認(rèn)為是人類和小鼠精子運(yùn)動(dòng)的主要能量來(lái)源。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明脂肪酸代謝在精子能量生成中的重要性。

SLC22A14調(diào)節(jié)精子能量代謝過(guò)程示意圖

針對(duì)附睪尾部精子的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析表明Slc22a14敲除的精子內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化和TCA 循環(huán)的中間代謝物顯著減少，并且發(fā)生了長(zhǎng)鏈游離脂肪酸和甘油三酯的蓄積，而糖酵解過(guò)程發(fā)生代償性升高，但仍不能彌補(bǔ)ATP生成的不足。

作者接下來(lái)采用放射性和非放射性同位素示蹤技術(shù)，檢測(cè)了碳同位素標(biāo)記的葡萄糖和脂肪酸底物在精子內(nèi)的代謝情況，同時(shí)利用能量代謝分析儀評(píng)估了精子細(xì)胞耗氧量和胞外產(chǎn)酸值的變化，最終證實(shí)Slc22a14 敲除的精子內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化（FAO）和氧化磷酸化（OXPHOS）途徑均存在缺陷，并且糖脂氧代謝途徑發(fā)生了重編程。

作者發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸約占精子內(nèi)總脂質(zhì)含量的25%，并且多種FAO相關(guān)蛋白質(zhì)在精子內(nèi)呈高豐度表達(dá)，而盡管FAO產(chǎn)ATP的量只占正常精子ATP生成總量的30%，但它對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)和生育能力是不可或缺的。

作為一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SLC22A14的細(xì)胞內(nèi)定位是什么以及通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)何種底物來(lái)發(fā)揮作用的呢？作者利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)和超高分辨率顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，SLC22A14是定位于精子線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。精子是高度特化的一類細(xì)胞，無(wú)法大量體外擴(kuò)增，并且在體外存活時(shí)間短，很難分離出有活性的線粒體。因此，作者采用SLC22A14過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系作為研究模型，結(jié)合線粒體代謝組學(xué)、放射性或非放射性同位素標(biāo)記底物攝取實(shí)驗(yàn)以及核黃素缺乏的小鼠模型，鑒定出了核黃素為SLC22A14的底物之一。

核黃素是FMN和FAD的前體，是FAO、TCA 循環(huán)、ETC 復(fù)合物I 和II 的輔因子。此外，作為抗氧化劑，核黃素還可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Slc22a14基因敲除干擾核黃素進(jìn)入線粒體基質(zhì)的運(yùn)輸過(guò)程，導(dǎo)致FMN和FAD耗竭和黃素酶活性降低，從而抑制ATP的合成，誘發(fā)精子功能損傷以及雄性不育。

SLC22A14位于線粒體內(nèi)膜，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素介導(dǎo)精子的長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化過(guò)程并影響精子的受精能力

該研究首次對(duì)精子這一特殊細(xì)胞類型的能量代謝展開(kāi)較為系統(tǒng)的研究，填補(bǔ)了精子能量代謝領(lǐng)域和線粒體核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究領(lǐng)域的部分空白。一方面，作為精子特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SLC22A14 可以潛在地應(yīng)用到以控制精子代謝為靶標(biāo)的男性避孕藥的開(kāi)發(fā)；另一方面，對(duì)SLC22A14 的研究可為臨床男性不育診治提供理論依據(jù)。

清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功研究員為本文的通訊作者。藥學(xué)院已畢業(yè)博士生匡文華為本文第一作者。實(shí)驗(yàn)室成員張杰、蘭洲、馬志龍、程麗麗、趙心彬、羅琪和孟子裔，新加坡A*STAR研究所范昊研究員、中科院動(dòng)物所李衛(wèi)研究員、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家奎研究員等為本項(xiàng)研究工作做出了重要貢獻(xiàn)。

此項(xiàng)工作得到比爾梅琳達(dá)蓋茨基金會(huì)、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)自然基金委重大研究計(jì)劃和北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的基金支持。