「青蓮聚焦」修飾蛋白組學(xué)之富“甲”一方

? ? ? ?蛋白質(zhì)的甲基化（Methylation）是指將甲基在酶的作用下轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的某個殘基上，通常是賴氨酸或精氨酸，也包括組氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺等。賴氨酸側(cè)鏈上?-氨基上有三個氫可以被替換為甲基，因而賴氨酸上可以有單甲基化、雙甲基化和三甲基化3種不同的修飾；而精氨酸有兩個可以被甲基修飾的氨基基團(tuán)，因此γ-氨基精氨酸上可以有單甲基化、對稱雙甲基化和不對稱雙甲基化3種修飾，其在生物體內(nèi)的動態(tài)平衡受到賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(KMT)和賴氨酸去甲基化酶( KDM)的調(diào)控。蛋白質(zhì)的甲基化是一種普遍的修飾，經(jīng)常與乙?；⒘?，因為它們都是常見的表觀遺傳修飾，經(jīng)常發(fā)生在組蛋白上，組蛋白甲基化（histonemethylation）是發(fā)生在H3和H4組蛋白N端賴氨酸(K)或精氨酸(R)殘基上的甲基化。組蛋白甲基化功能主要與形成和維持異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、基因組印跡、DNA修復(fù)、X染色質(zhì)的失活和轉(zhuǎn)錄等調(diào)控方面息息相關(guān)。此外，非組蛋白上賴氨酸甲基化也漸漸被發(fā)現(xiàn)，參與發(fā)育、細(xì)胞間相互作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。

? ? ?
? ?? ?青蓮百奧甲基化蛋白組學(xué)服務(wù)，利用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用平臺（LC-MS)，研究生物或細(xì)胞內(nèi)全部發(fā)生甲基化的蛋白質(zhì)（大規(guī)模、高通量）的定性和定量包括蛋白的表達(dá)水平、修飾位點、參與的生物學(xué)過程以及蛋白與蛋白相互作用等，以期應(yīng)用到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)藥闡述疾病的發(fā)病機理及耐藥機制），揭示生物脅迫作用。

甲基化蛋白組學(xué)流程

案例分析

MRPS23的精氨酸和賴氨酸甲基化通過調(diào)節(jié)OXPHOS促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移
?

研究背景
? ? ? ?線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。然而，OXPHOS促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子事件和調(diào)控機制的詳細(xì)描述至今仍不清楚。線粒體核糖體蛋白S23 (MRPS23)是高度保守的線粒體核糖體小亞基的組成部分。在心臟病代謝綜合征中，MRPS23突變時，呼吸鏈復(fù)合物I和IV中的酶活性降低。此外，MRPS23高表達(dá)有助于肝癌和乳腺癌的細(xì)胞增殖。然而，MRPS23與人乳腺癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系至今尚未被研究。此外，MRPS23蛋白的翻譯后修飾(PTM)尚未得到充分的研究。

?

研究內(nèi)容
? ? ? ?在這項研究中，研究人員證明了MRPS23的R21和K108位點分別被PRMT7和SETD6甲基化。R21甲基化加速了MRPS23蛋白的多聚泛素依賴性降解到低水平。這種降解抑制OXPHOS產(chǎn)生mtROS促進(jìn)轉(zhuǎn)移。此外R21甲基化和K108甲基化可以協(xié)同作用，將MRPS23的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)到較低水平，從而支持乳腺癌細(xì)胞的生存。本研究的結(jié)果為深入了解PTMs調(diào)控OXPHOS在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機制奠定了基礎(chǔ)，也為探索PRMT7-SETD6-MRPS23軸作為高侵襲性乳腺癌治療干預(yù)的潛在靶點奠定了基礎(chǔ)。
?

研究結(jié)果
?

一、MRPS23在R21位點被PRMT7甲基化

此前研究表明蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7(PRMT7)能夠促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。研究人員首先對穩(wěn)定的3×Flag-PRMT7復(fù)合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析(MS)，發(fā)現(xiàn)MRPS23是PRMT7相互作用蛋白，互作共免疫沉淀證明GST-MRPS23與3×Flag-PRMT7之間存在直接相互作用。

接著利用質(zhì)譜手段鑒定MRPS23的精氨酸位點，結(jié)果顯示5個精氨酸殘基(Arg5、Arg21、Arg69、Arg133和Arg157)均為單甲基化。隨后研究人員將每個精氨酸殘基分別突變?yōu)橘嚢彼?R5K, R21K, R69K, R133K，和R157K)，進(jìn)行體外甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)MRPS23 R21K降低了MRPS23甲基化(圖1f)，并利用特異識別MRPS23 R21單甲基化的多克隆抗體，驗證了特異性。PRMT7過表達(dá)增加了MRPS23 R21的甲基化(圖1g)，PRMT7敲低可降低內(nèi)源性MRPS23甲基化程度(圖1h)，以上結(jié)果均證明MRPS23被PRMT7甲基化。

二、MRPS23 R21甲基化通過抑制OXPHOS增強乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

? ? ? ?研究人員假設(shè)MRPS23的精氨酸甲基化促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。首先評估了MRPS23 WT、R21K或R21F對遷移和侵襲的影響，結(jié)果表明，MRPS23 R21K與MRPS23 WT和R21F相比遷移和侵襲能力顯著下降(圖2a, b)。為了證明MRPS23 R21me1在體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的重要作用，作者將MCF7-PRMT7/ MRPS23 WT或MRPS23 R21K注入裸鼠尾靜脈，發(fā)現(xiàn)與MRPS23 R21K細(xì)胞相比，MRPS23 WT細(xì)胞注射的裸鼠肺具有明顯更高的光通量(Fig.2c)，出現(xiàn)了更多肉眼可見的肺轉(zhuǎn)移(Fig.2d)，表明MRPS23 R21me1促進(jìn)了乳腺癌轉(zhuǎn)移。? ? ? ?接下來研究MRPS23 R21甲基化是否調(diào)控了OXPHOS。在MCF7細(xì)胞中檢測PRMT7過表達(dá)后OXPHOS在MCF7細(xì)胞中被抑制(圖2e, f)，PRMT7敲低顯著增加OXPHOS(圖2g, h)。因此，MRPS23精氨酸甲基化可能抑制OXPHOS生成mtROS，進(jìn)一步促進(jìn)遷移。用mitoTEMPO處理MCF7-PRMT7/MRPS23 WT細(xì)胞，mitoTEMPO抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，最終說明R21甲基化通過mtROS促進(jìn)遷移和侵襲。

三、MRPS23 R21甲基化促進(jìn)了MRPS23蛋白的低水平降解

? ? ???作者發(fā)現(xiàn)PRMT7過表達(dá)或敲低對MRPS23 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平影響不大(Fig.3a, b)，這一現(xiàn)象的直接原因是PRMT7可能影響MRPS23蛋白的穩(wěn)定性。用蛋白酶體抑制劑MG132或蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己亞胺(CHX)處理MCF7-PRMT7細(xì)胞，結(jié)果表明，PRMT7促進(jìn)了MRPS23蛋白的降解(Fig.3c, d)，推測PRMT7可能通過R21甲基化影響MRPS23蛋白的穩(wěn)定性。MG132抑制了MRPS23 WT和R21F蛋白的降解(圖3f)，說明甲基化促進(jìn)了MRPS23的降解。PRMT7過表達(dá)后MRPS23泛素化增加(圖3g)，MRPS23 WT和R21F泛素化顯著增加(圖3h)。因此，R21甲基化通過增加MRPS23的泛素化來降低其穩(wěn)定性。

? ? ? ?隨著PRMT7的逐漸增加，MRPS23逐漸下降，直到達(dá)到一個較低的水平(圖3i)，這表明細(xì)胞存活可能需要相對較低水平的MRPS23蛋白。通過慢病毒系統(tǒng)過表達(dá)了兩個針對MRPS23的獨立?shRNAs證明這一點。

四、MRPS23 K108甲基化與R21甲基化協(xié)同，維持MRPS23的低水平

? ? ???此外，作者發(fā)現(xiàn)MRPS23賴氨酸甲基化和SETD6也被檢測到，表明MRPS23也可能被SETD6甲基化。在MCF7細(xì)胞中證實了SEDT6-MRPS23的內(nèi)源性相互作用(圖4a)，隨后檢測到GST-MRPS23與His-SETD6之間存在直接相互作用(圖4b)，進(jìn)一步進(jìn)行了體外甲基化實驗，證明MRPS23被SETD6甲基化(圖4c)。緊接著進(jìn)行了質(zhì)譜分析確定甲基化的賴氨酸位點，(Lys28, Lys57, Lys108和Lys150)被甲基化(圖4d)。MS分析顯示K108R位點為二甲基化(圖4d)。利用特異性多克隆抗體，識別了MRPS23的K108二甲基化位點，發(fā)現(xiàn)SETD6敲低可降低K108位點的甲基化(圖4f)，由此證明MRPS23 K108甲基化是由SETD6催化的。

? ? ? ?研究人員隨后探索了K108和R21的甲基化是否協(xié)調(diào)維持了MRPS23蛋白的低水平。通過檢測MCF7-PRMT7和MDA-MB-231細(xì)胞在低水平MRPS23環(huán)境下賴氨酸和精氨酸甲基化的情況發(fā)現(xiàn)當(dāng)MRPS23蛋白維持在較低水平時，它在K108和R21位點都發(fā)生了甲基化(Fig.4g)。SETD6敲低顯著降低了MRPS23低水平的蛋白水平(圖4h)，而SETD6敲低對MRPS23 mRNA水平影響不大。這些數(shù)據(jù)表明，K108甲基化可能也參與了MRPS23的穩(wěn)定性，用MG132或CHX處理模型細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)K108甲基化增加了MRPS23的穩(wěn)定性。K108和R21甲基化協(xié)同控制MRPS23的泛素化狀態(tài)，導(dǎo)致MRPS23蛋白水平較低。

五、MRPS23 K108甲基化通過調(diào)節(jié)OXPHOS在乳腺癌細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用

? ? ? ?通過測試MRPS23 K108甲基化對乳腺癌細(xì)胞存活的影響發(fā)現(xiàn)MRPS23 K108R在MCF7shMRPS23#2細(xì)胞中激活了早期凋亡(Fig.5a)并抑制了增殖(Fig.5b)，表明K108甲基化可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活。MRPS23和SETD6基因敲低激活了早期凋亡。

六、MRPS23、R21和K108甲基化與高級別乳腺癌相關(guān)

? ? ? ?為了進(jìn)一步研究MRPS23甲基化如何參與乳腺癌進(jìn)展，作者比較了MCF10A、MCF7、T47D、BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中PRMT7、SETD6和MRPS23的表達(dá)水平。與MCF7相比，BT549、MDA-MB-231等高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中PRMT7、SETD6表達(dá)顯著升高，MRPS23表達(dá)降低(圖6a)。說明MRPS23的低表達(dá)是由PRMT7和SETD6調(diào)控的，從而增加遷移和侵襲。低水平的MRPS23蛋白可能預(yù)示著明顯的不良預(yù)后。為了驗證這一假設(shè)，對145例乳腺腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了MRPS23免疫組化(IHC)染色，乳腺組織中低MRPS23蛋白水平預(yù)示預(yù)后明顯不良(圖6d)。同時，MRPS23高表達(dá)也預(yù)示著預(yù)后明顯不良(Fig.6c, d)。最后利用抗MRPS23 R21me1和抗MRPS23 K108me2抗體，通過免疫沉淀法檢測50例乳腺腫瘤樣本中MRPS23的精氨酸和賴氨酸甲基化。結(jié)果顯示，MRPS23 R21me1和K108me2的水平非常高。MRPS23蛋白水平與MRPS23 R21me1或PRMT7表達(dá)呈負(fù)相關(guān);而MRPS23蛋白水平與MRPS23 K108me2或SETD6表達(dá)呈正相關(guān)(圖6e, f)。這些結(jié)果表明，低水平的MRPS23蛋白與高水平的MRPS23 R21me1和K108me2相關(guān)。

總結(jié)
? ? ? ?這項研究發(fā)現(xiàn)了PRMT7和SETD6誘導(dǎo)的MRPS23精氨酸和賴氨酸甲基化在低水平上調(diào)節(jié)MRPS23蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制線粒體OXPHOS，生成mtROS，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。PRMT7-SETD6-MRPS23軸參與乳腺癌發(fā)生的表現(xiàn)，可能通過靶向該軸的成員，為開發(fā)潛在的乳腺癌干預(yù)治療策略提供基礎(chǔ)。

青蓮百奧

甲基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

樣品與運輸

? ? ? ?樣本取得后最佳方案：液氮速凍30min-1h，如不能及時寄送，請于-80℃冰箱保存，足量干冰運輸寄給我們。

? ? ? ?注：在正式實驗之前，我們都會對您提供的樣品進(jìn)行質(zhì)控檢測，檢測合格后開始正式試驗。

? ? ? ?青蓮百奧可提供一站式蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、多組學(xué)聯(lián)合分析等科研服務(wù)。青蓮百奧在生物活性肽檢測項目經(jīng)驗豐富，界內(nèi)最全的Bioactive Database、NeuroPedia Database，專業(yè)分析軟件Peaks、Spectronaut，海歸坐鎮(zhèn)生信分析團(tuán)隊，助您在科研道路上乘風(fēng)破浪，沖擊高水平文章。

更多技術(shù)服務(wù)敬請來電咨詢

010-53395839