一. 產(chǎn)品介紹

rProtein G Beads 4FF是用于分離和純化lgG的親和層析介質(zhì)，具體性能見表1。ProteinG是一種分離自G Streptococci的細(xì)胞壁蛋白，它可通過其Fc 片段結(jié)合哺乳動物IgG。重組protein G含有高親和結(jié)合位點(diǎn)，減少了非特異性吸附。Protein G 和Protein A 有不同的lgG結(jié)合特性，相比Protein A， Protein G對牛、羊、馬等多克隆抗體有更強(qiáng)的結(jié)合力，它還可以結(jié)合不能與Protein A 很好結(jié)合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1。rProtein G Beads 4FF是以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，可以在相對較高的流速下進(jìn)行單克隆抗體和多克隆抗體的純化。

表1.?rProtein G Beads 4FF產(chǎn)品性能

項(xiàng)目

性能

介質(zhì)

高度交聯(lián)的4%瓊脂糖

平均粒徑

～45-165

配體

重組蛋白G

結(jié)合載量

> 30 mg?人lgG/ml 介質(zhì)

工作pH

3-10

最大壓力

0.3MPa 3bar

保存

20%?乙醇， 2℃ - 8℃

?

二. 純化流程

1. Buffer?的準(zhǔn)備

所用水和Buffer 在使用之前建議用0.22μm 或0.45μm 濾膜過濾。

結(jié)合緩沖液/洗滌緩沖液：0.15 M 氯化鈉、20 mM 磷酸氫二鈉，pH7.0

洗脫液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl 緩沖液，pH 8.5 。

2.?樣品準(zhǔn)備

上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強(qiáng)度和pH 值，可以用結(jié)合/洗滌緩沖液對血清樣品、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，或者樣品用結(jié)合/洗滌緩沖液透析。樣品在上樣前建議離心或用0.22μm 或0.45μm 濾膜過濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

3.rProtein G Beads 4FF裝填

rProtein G Beads 4FF被廣泛應(yīng)用于工業(yè)純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下面介紹使用rProtein G Beads 4FF填裝層析柱的方法。

層析柱的裝填（使用儲液器裝填）

1)用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去離子水。

2)將樹脂懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3)如果使用儲液器，應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4)打開層析柱底部出口，開起泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(gè)很好的裝填效果。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3 倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5)關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6)如果使用儲液器，去除儲液器，將分配器至于層析柱中。

7)將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。

8)將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

4.樣品純化

1)?將rProtein G Beads 4FF裝入合適的層析柱，層析用5 倍柱體積的結(jié)合液進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。

2)?將樣品加到平衡好的rProtein G Beads 4FF中（保證目的蛋白與rProtein G Beads4FF充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3)?用10-15倍柱體積的洗雜液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4)?使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

5)?依次使用3 倍柱體積的結(jié)合液和5 倍柱體積的去離子水平衡填料，最后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被細(xì)菌污染。

5.SDS-PAGE?檢測

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

三. 填料清洗

rProtein G Beads 4FF可以重復(fù)使用而無需再生，但隨著一些變性物質(zhì)的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和結(jié)合載量都下降，嚴(yán)重影響柱子的性能，這時(shí)需要對樹脂進(jìn)行清洗。去除一些沉淀或變性物質(zhì)用 2倍柱體積的6M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5 倍柱體積的PBS, pH 7.4 清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)用 3-4倍柱體積的70%乙醇或2 倍柱體積的1% Triton? X-100 清洗，然后然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)

用 3-4倍柱體積的70%乙醇或2 倍柱體積的1% Triton? X-100 清洗，然后然后立即用5倍柱體積的PBS， pH 7.4清洗。

四. 問題及解決方案

問題

原因分析

推薦解決方案

柱子反壓過高

篩板被堵塞

清洗或更換篩板

填料被堵塞

按照第3部分進(jìn)行樹脂CIP清洗

裂解液中含有微小的固體顆粒，建立上柱前過濾

樣品純化過程中曲線不穩(wěn)

樣品或buffer中有氣泡

取出樣品或柱子中的氣泡

樣品和buffer進(jìn)行脫氣

洗脫組分中沒有目的蛋白

樣品中抗體濃度太低

使用其抗原做配體的介質(zhì)

抗體被降解

適當(dāng)?shù)奶岣呦疵揚(yáng)h

回收率逐漸減低

上樣量太多

減少上樣量

柱子太臟

按照第3部分進(jìn)行樹脂CIP清洗