銀屑病（Psoriasisis）是一種與免疫相關(guān)的慢性炎癥疾病，因其皮損泛發(fā)，瘙癢、干燥顯著，易復(fù)發(fā)，無(wú)法根治，給患者帶來(lái)了極大的心理壓力，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。角質(zhì)形成細(xì)胞中絲蘇氨酸蛋白磷酸酶-6（PP6）的表達(dá)失衡是銀屑病炎癥的主要原因，平衡角質(zhì)形成細(xì)胞中PP6的表達(dá)有望成為治療銀屑病的全新策略。

2022年12月19日上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院的王宏林教授和他的團(tuán)隊(duì)在nature communications上發(fā)表了題為“Targeting the transcription factor Hes1 by L-menthol restores protein phosphatase 6 in keratinocytes in models of psoriasis”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)L-薄荷醇能夠通過(guò)靶向結(jié)合Hes1促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中PP6的表達(dá)進(jìn)而改善銀屑病樣皮膚炎癥。

值得注意的是，在本研究中，作者使用了漢恒生物提供的腺病毒（Ad）和腺相關(guān)病毒（AAV9），成功在體內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)了PP6、Hes1的敲低和過(guò)表達(dá)。

接下來(lái)我們看看文章的研究結(jié)果：

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮膚中PP6的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照，作者用Ad-shPP6腺病毒敲低HaCaT細(xì)胞中PP6后，通過(guò)3D培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PP6的敲低能促進(jìn)細(xì)胞表皮增生。

圖1? 角質(zhì)形成細(xì)胞中 PP6的下調(diào)增加了皮膚的表皮厚度

接著，作者利用化合物庫(kù)Tsbiochem篩選到化合物L(fēng)-薄荷醇能顯著提高HaCaT中PP6的蛋白水平，但有趣的是，它并不影響細(xì)胞的活力和PP6的mRNA水平。作者利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討了L-薄荷醇對(duì)銀屑病的治療作用，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，L-薄荷醇減輕了小鼠耳朵的炎癥表型（紅斑、厚度和脫屑），同時(shí)減少了損傷皮膚的表皮厚度、細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子和Ki67的表達(dá)；此外，局部應(yīng)用L-薄荷醇可顯著提高表皮中PP6蛋白水平。

圖2 L-薄荷醇上調(diào)炎性角質(zhì)形成細(xì)胞中 PP6的表達(dá)，減輕IMQ誘導(dǎo)的皮膚炎癥

為了進(jìn)一步探討L-薄荷醇對(duì)銀屑病的治療作用是否依賴(lài)于PP6，作者使用PP6基因敲除小鼠K5. Pp6fl/fl和正常小鼠Pp6fl/fl作為研究工具；發(fā)現(xiàn)L-薄荷醇對(duì)Pp6fl/fl銀屑病小鼠表型有顯著改善（表皮厚度、皮膚浸潤(rùn)以及Ki67的表達(dá)顯著下降），并且促進(jìn)PP6的表達(dá)，而對(duì)于K5.Pp6fl/fl銀屑病小鼠則不能帶來(lái)相應(yīng)改變。

圖3 L-薄荷醇在角質(zhì)形成細(xì)胞中的抗炎作用依賴(lài)于PP6

接著，作者通過(guò)DARTS技術(shù)聯(lián)合無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜法篩選到L-薄荷醇的靶蛋白Hes1，并且在HaCaT和小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞中驗(yàn)證了兩者的作用；此外，借助微量熱泳動(dòng)儀(MST)獲得了L-薄荷醇與Hes1間的解離常數(shù)。通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序（scRNA-seq）發(fā)現(xiàn)Hes1主要在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，并且，銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞以及表皮中Hes1的表達(dá)顯著低于對(duì)照組。作者隨后構(gòu)建了體內(nèi)、體外銀屑病模型，用L-薄荷醇處理，出現(xiàn)了類(lèi)似于PP6的結(jié)果，即L-薄荷醇能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中Hes1蛋白的表達(dá)，但不影響其轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，L-薄荷醇能夠通過(guò)抑制蛋白酶體對(duì)Hes1蛋白的降解進(jìn)而增加Hes1蛋白的水平。

圖4 L-薄荷醇靶向角質(zhì)形成細(xì)胞中的Hes1并且上調(diào)其表達(dá)

作者使用K5. Hes1fl/fl和Hes1fl/fl小鼠作為研究工具，發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞缺失Hes1能加重IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病表型，即K5. Hes1fl/fl小鼠表皮厚度、細(xì)胞浸潤(rùn)以及損傷表皮細(xì)胞中Ki67的表達(dá)顯著增加，與Hes1fl/fl銀屑病模型小鼠相比，K5. Hes1fl/fl銀屑病模型小鼠表皮中PP6的蛋白水平更低，但是mRNA水平?jīng)]有差異。同樣，在HaCaT細(xì)胞中干擾Hes1后，PP6的蛋白水平降低，但PP6 mRNA水平并不改變。作者利用Ad-shHes1在NHEK細(xì)胞中敲低Hes1的表達(dá)后，顯著促進(jìn)了NHEK細(xì)胞的異常增殖。另外，在動(dòng)物水平上，與PP6的研究結(jié)果類(lèi)似， L-薄荷醇可以顯著改善Hes1fl/fl銀屑病小鼠表型（表皮厚度、皮膚浸潤(rùn)以及Ki67的表達(dá)顯著下降），并且促進(jìn)PP6的蛋白表達(dá)；L-薄荷醇處理的K5.Hes1fl/fl銀屑病小鼠表皮厚度、皮膚浸潤(rùn)以及Ki67的表達(dá)均未發(fā)生變化。

圖5 L-薄荷醇在角質(zhì)形成細(xì)胞中調(diào)控PP6的表達(dá)依賴(lài)于Hes1

前期的研究表明Hes1表達(dá)失衡只能改變PP6的蛋白水平而不影響其轉(zhuǎn)錄，為探究其原因，作者利用CO-IP-MS篩選到PP6的互作蛋白IGBP1，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Hes1與PP6直接結(jié)合。作者以Hes1f1/f1小鼠和K5.Hes1f1/f1小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)L-薄荷醇只能上調(diào)Hes1f1/f1小鼠表皮中Hes1和Igbp1的表達(dá)，而不影響K5.Hes1f1/f1小鼠表皮中Hes1和Igbp1的表達(dá)；并且，K5.Hes1f1/f1銀屑病小鼠表皮中Igbp1的mRNA水平顯著低于Hes1f1/f1銀屑病小鼠，作者通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HES1通過(guò)與IGBP1的啟動(dòng)子結(jié)合激活I(lǐng)GBP1的轉(zhuǎn)錄。接著，作者利用AAV9-Hes1 在銀屑病小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)HES1，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HES1明顯改善了銀屑病小鼠的表型（表皮厚度，真皮細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮Ki67表達(dá)顯著降低）。此外，在銀屑病HaCat細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中過(guò)表達(dá)HES1均能上調(diào)IGBP1和PP6的蛋白水平。

圖6 HES1轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)GBP1的表達(dá)

最后，作者利用rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在HaCaT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IGBP1能夠逆轉(zhuǎn)由HES1敲低導(dǎo)致的PP6下調(diào)表達(dá)；此外，在角質(zhì)形成細(xì)胞中干擾Igbp1能顯著降低PP6的表達(dá)，并且，IGBP1的下調(diào)促進(jìn)PP6的泛素化；相反，過(guò)表達(dá)Igbp1，能顯著增加PP6的表達(dá)并減少PP6的泛素化。

圖7 IGBP1促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中PP6的表達(dá)

綜上所述，L-薄荷醇能通過(guò)靶向結(jié)合Hes1激活I(lǐng)gbp1轉(zhuǎn)錄，Igbp1通過(guò)抑制E3泛素連接酶與PP6的結(jié)合來(lái)抑制其泛素化，從而促進(jìn)PP6在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)。本研究闡述了L-薄荷醇治療銀屑病的作用機(jī)制，為銀屑病的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。