水塑物語：分子結(jié)晶的那些事

本次公開課的主題是藥物結(jié)晶。藥物結(jié)晶有很多方向，本次課程可能不會介紹所有方向。我打算分三部分介紹這個話題，第一部分是結(jié)晶如何影響了你的生活，第二部分是小分子有機藥物中的結(jié)晶，第三部分是大分子生物醫(yī)藥中的結(jié)晶。小分子中的結(jié)晶有很多研究方向，今天主要就大家比較感興趣的藥物結(jié)晶進行介紹；大分子生物醫(yī)藥中的結(jié)晶主要介紹經(jīng)常使用的技術(shù)手段以及我們在做的短肽結(jié)晶研究。

什么是晶體與結(jié)晶？

晶體是原子、離子或分子在空間作三維周期性的規(guī)則排列形成的具有一定規(guī)則幾何外形的固體。在生活中比較常見的是我們在廚房做飯的時候，會發(fā)現(xiàn)鹽、糖是透明且有規(guī)則外形，這就是晶體；深挖其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，會發(fā)現(xiàn)這些固體內(nèi)部的分子是呈三維周期性規(guī)則排列。這（圖1）是一幅晶體的圖。

圖1. 晶體

我們可以看到晶體有不同的形狀，如片狀、菱形以及柱狀，每一個晶體由一個個分子、原子或離子組成。上圖中第二個結(jié)構(gòu)圖（左二）是單氨酸三肽二水合物的分子，可以看到這個分子會形成晶胞，那什么是晶胞呢？晶胞類似于積木，每一個晶胞是一塊積木；積木塊以比較重復(fù)的規(guī)則的排列方式構(gòu)成具有一定規(guī)則外形的固體；每一塊積木不只可以形成一個組合，而是可以用積木搭成各種形狀，不同的外形就會導(dǎo)致多晶型的現(xiàn)象。同一種物質(zhì)具有兩種或兩種以上的空間排列和晶胞參數(shù)的現(xiàn)象，稱為多晶型的現(xiàn)象。晶胞里面的分子也會改變，比如將其現(xiàn)在的彎曲構(gòu)象弄直，這樣晶胞的變化也會導(dǎo)致多晶型的現(xiàn)象。結(jié)晶是從過飽和的溶液中凝結(jié)，或從氣體凝華成晶體的過程。

結(jié)晶如何影響了你的生活？

在了解晶型和多晶型之后，我想給大家介紹生活中已有但是你可能并不知道的結(jié)晶現(xiàn)象。首先是衣食住行方面大家最感興趣的——吃；大家都吃過巧克力，那么巧克力是由什么構(gòu)成的呢？巧克力的主要成分是奶粉、蔗糖以及可可脂等。可可脂有六種晶型，下圖(圖2)表里的六種晶型是按照熔點依次遞增的順序列出的，分別命名為晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

圖2 . 結(jié)晶與生活

從圖2中可以觀察到晶型Ⅴ和晶型Ⅵ的外觀有顯著差別，晶型 Ⅵ的表面上有肉眼可見的白色霜花。巧克力廠商需要在六種晶型里面選出一種更符合消費者口味的晶型，最好的選擇是看起來比較好看的晶型Ⅴ。但是晶型Ⅴ并不是最穩(wěn)定的晶型，所謂最穩(wěn)定的晶型往往是有最高熔點的晶型。從表中可以看到晶型Ⅵ有最高的熔點——36.3℃，晶型Ⅴ的熔點是33.8℃。那為什么要選擇晶型Ⅴ呢？因為它的熔點只有33.8℃，所以會快速融化在口腔中，就像很多巧克力的廣告語“入口絲滑”的感覺。如果選用晶形Ⅵ，晶形Ⅵ的熔點接近人體體溫，需要一段時間才可以融化，就不會有“入口即化”的感覺。盡管晶型Ⅵ是最穩(wěn)定的晶型，但因較長的融化過程會產(chǎn)生消費者并不喜歡的比較粗糙、不順滑的口感，而且晶型Ⅴ的外形更美觀，所以巧克力廠商需要掌握介穩(wěn)晶型即晶型Ⅴ的結(jié)晶技術(shù)，才可以生產(chǎn)出合格、受消費者歡迎的巧克力。類似的食品是夏天的冰淇淋，冰淇淋也有不同的晶體型號，類似于巧克力的晶型Ⅴ和晶型Ⅵ；冰淇淋的形狀和粒度會影響外觀和口感。在冰淇淋中除了冰晶之外，脂質(zhì)的晶型、蔗糖的晶型都會有影響。既然談到冰淇淋的冰晶，就有一個更加浪漫的冰晶——雪。

圖3. 雪

圖3中左上角是倫敦塔橋在下雪。大家漫步在冬天的雪路上的時候，有沒有考慮過踩的每片雪花是什么形狀？追溯到古代詩詞，就會發(fā)現(xiàn)很多古代詩人在贊揚雪花時都提到了雪花是六花，詩人們會叫六花飛或六出飛花，所以在古代詩人眼中的雪花就是六片。那么雪花有沒有別的形狀呢？在 20 世紀(jì) 30 年代，日本的物理學(xué)家中谷宇吉郎研究了不同溫度、濕度下雪花的晶體形狀。所謂不同濕度就是不同的過飽和度，因為雪是由水組成的。這個圖（圖3左二）也叫中谷圖，從圖中可以看到不同的溫度范圍會形成不同的雪花。所以古代詩人看到的雪花基本上都是 0 到-5或-15℃左右出現(xiàn)的六菱形雪花，其他溫度范圍可能會出現(xiàn)針狀或柱狀雪花，所以不同晶型的雪花在生活中也是比較常見的。

圖4.金剛石與石墨

另一個比較常見的是鉆石，鉆石是由金剛石打磨的。雖然鉆石比較堅硬，但是另一個同樣都是碳元素組成的石墨是一種比較柔軟的物質(zhì)。盡管都是由碳元素組成，但是排列方式不同導(dǎo)致了它們具有完全不同的物理性質(zhì)。金剛石的每個碳原子是呈立方體的形式組成的，它的距離是 0.154 納米。石墨是層狀的結(jié)構(gòu)，每一層的距離是 0.335 納米，每一層是范德華力的結(jié)合作用。我們小時候用鉛筆會發(fā)現(xiàn)石墨比較粘膩但容易滑動，就是因為范德華力作用比較弱，導(dǎo)致它比較柔軟。

小分子有機藥物中的結(jié)晶

藥物多晶型廣泛存在

不同排列結(jié)構(gòu)導(dǎo)致顯著的物理化學(xué)性質(zhì)差異也體現(xiàn)在藥物中。藥物多晶型是結(jié)晶研究中比較廣泛的一個分支。在一個統(tǒng)計調(diào)查中，科學(xué)家們篩選了245 種藥物多晶型，結(jié)果表明90% 的藥物都有多晶型的現(xiàn)象。下圖（圖5）中的表格是幾種比較常用的藥物，每一種藥物都有不同的晶型，甚至有些藥物有多種晶型。不同的晶型導(dǎo)致不同的硬度。除此之外，我們要考慮藥物的物理化學(xué)性質(zhì)、化學(xué)動力學(xué)、機械性能、物理性能、表面性質(zhì)以及熱力學(xué)等。針對于藥物晶型方面，我們更加關(guān)注的是動力學(xué)中的溶解速率、晶體生長以及穩(wěn)定性。溶解速率是藥物在體內(nèi)的溶出度；穩(wěn)定性也很重要，因為制作完成后的藥品需要儲存很長時間，比如藥品的保質(zhì)期可能是兩年或者三年，在這么長的時間里晶型是否發(fā)生改變。在工業(yè)生產(chǎn)中，晶體生長速率快就比較省時，生長較慢則比較費時。強度、顆粒流動等機械性能是在結(jié)晶過程后續(xù)的過濾以及壓片制劑的情況下需要考慮的一些性能；表面張力、表面自由能等在成核的過程中是很重要的。溶解度、熱力學(xué)性質(zhì)以及熵焓與多晶型息息相關(guān)，不同的多晶形溶解度不同，焓值也不同，會導(dǎo)致設(shè)計結(jié)晶時需要用到不同的條件。

圖5.藥物多晶型廣泛存在

如果沒有對藥品進行詳細(xì)的多晶型研究，就把藥品推廣到市場上進行上市，最后再發(fā)現(xiàn)藥品存在多晶型，就會導(dǎo)致很悲慘的藥品召回事故，下圖（圖6）顯示了30 多年來的一些藥品召回的事件。

圖6. 多晶型導(dǎo)致的藥品召回事件

第一個是 1988 年的卡馬西平，是從無水物轉(zhuǎn)化為二水合物；甲苯咪唑是發(fā)現(xiàn)了它有其他的無活性的多晶型。藥物是溶劑化合物可能會導(dǎo)致溶劑流失、無定型等，如華法令鈉；羅替戈汀出現(xiàn)了雪花狀的新晶型；厄貝沙坦低溶解度的晶型的出現(xiàn)導(dǎo)致了低溶出度。這些藥品都是上市之后發(fā)現(xiàn)藥品轉(zhuǎn)變成其他晶型或出現(xiàn)混晶，導(dǎo)致藥品召回而給公司造成巨大損失。一個很典型的例子是 1998 年抗艾滋、抗病毒藥利托那韋，這個藥品是比較波折的；此藥開始使用的是晶型Ⅰ，上市兩年后發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了熱力學(xué)更穩(wěn)定的晶型Ⅱ，因為熱力學(xué)更穩(wěn)定也導(dǎo)致它有比較低的溶解度和溶出度。特別有意思的在發(fā)現(xiàn)晶型Ⅱ后，科學(xué)家嘗試做晶型Ⅰ，卻發(fā)現(xiàn)即使應(yīng)用很多不同的結(jié)晶方式，也做不出來晶型Ⅰ。正因如此也令其原研公司雅培公司一度陷入了輿論危機，導(dǎo)致公司損失了幾億美元。后來雅培公司的科學(xué)家制定了幾種方案，要么研制晶型Ⅱ的新制作流程，要么探究如何形成晶型Ⅰ。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)晶型Ⅱ的制作是很容易，且在研究中發(fā)現(xiàn)在制作結(jié)晶時存在微量的晶型Ⅱ，這相當(dāng)于加入晶種，所以就不會存在晶型Ⅰ而只能生成晶型Ⅱ。

晶型專利

多晶型還是很危險的，尤其對于花費了五六十年的時間、投入了數(shù)十億美元的原研藥公司而言；如果他們沒有搞清楚所有的晶型，那么前期的投入可能會大打折扣。多晶型的開發(fā)也成為延長藥品保護期限和拓寬市場的一個重要手段。一個廣為人知的例子是《我不是藥神》中的格列衛(wèi)，格列衛(wèi)的原始價格是2.5萬元左右一盒；在這個電影中，主人公在印度仿制藥公司購買了比較便宜的仿制藥。所謂仿制藥，是在一些比較重要的性質(zhì)上與原研藥相似或相同，只是在晶型方面或一些輔料添加上可能有些許不同。但是仿制藥需要在原研藥的專利到期之后才可以生產(chǎn)。影片中印度的仿制藥價格低廉，且有的仿制藥效果與原研藥相似，所以很多人會選擇服用仿制藥。

如果上市公司沒有發(fā)現(xiàn)新的晶型，只是發(fā)現(xiàn)了其中一個晶型；在專利過期后，其他公司發(fā)現(xiàn)了第二個晶型且效果更好，可以繼續(xù)申請新的關(guān)于晶型的專利，這對于原研公司是巨大的打擊。仿制藥并不是一個比較負(fù)面的藥，很多原研藥公司也有一些部門在做仿制藥，比如格列衛(wèi)的原研公司諾華也在進行仿制藥的生產(chǎn)，國內(nèi)也有很多公司在進行仿制藥的生產(chǎn)。

多晶型的種類

多晶型種類到底有多少種？什么是多晶型？一個分子在溶液里生成的固體有好幾類，除了多晶形，像下表中列出的晶形Ⅰ和晶型Ⅱ是同一個物質(zhì)因為不同的排列方式形成了兩種晶型。如果它沒有規(guī)則的排列方式，就被稱為無定型。在生產(chǎn)晶體的時候，會發(fā)現(xiàn)溶液里面的溶劑或水會在晶格里出現(xiàn)，這叫做溶劑化合物或水合物。另外它可以與一些鹽相互作用形成鹽，或者兩個不同的分子可以相互作用形成共晶。

圖7.多晶型的種類

多晶型的主要種類包括堆積多晶型和構(gòu)象多晶型。堆積多晶型就像用積木搭成不同的形狀，但每個積木都是一樣長方體。構(gòu)象多晶型是每一個晶胞里面的分子的構(gòu)象發(fā)生了變化；比如彎曲的構(gòu)象可以變成直的構(gòu)象，構(gòu)象的變化也會產(chǎn)生多晶型。

多晶型的形成

那么多晶型是怎么形成的？一個比較經(jīng)典的說法是Ostwald’s rule，討論了不同的晶體和多晶型的自由能，即最穩(wěn)定的晶型的自由能最低。所有的亞穩(wěn)晶型都是在最穩(wěn)定晶型之前出現(xiàn)的，所以都是先出現(xiàn)了亞穩(wěn)晶型再出現(xiàn)穩(wěn)定晶型。第二個說法是動力學(xué)成核理論，這個理論運用了經(jīng)典的成核理論，自由能可以表達成過飽和度、溫度、界面張力以及分子體積相關(guān)的函數(shù)。在動力學(xué)研究上發(fā)現(xiàn)成核速率與過飽和度息息相關(guān)。結(jié)合起來來看，穩(wěn)定晶型的成核能壘遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞穩(wěn)晶型，但是穩(wěn)定晶型的溶解度比較低，一般都會有更高的過飽和度。所以并不是所有不同的條件下介穩(wěn)晶型都是先出現(xiàn)的，有時是穩(wěn)定晶型先出現(xiàn)。如果在某些特定條件下介穩(wěn)晶型先出現(xiàn)，在經(jīng)歷很長時間后最終還會轉(zhuǎn)為熱力學(xué)最穩(wěn)定的晶型。還有一些理論可以幫助形成多晶型，如交叉成核是一個晶型長在另一個晶型上，在顯微鏡下可能會觀察到片狀晶型面可能會長一些針狀晶型，是因為先生成的有些晶型可能幫助降低第二晶型能壘，所以它就會長到另一個晶型上面。二次成核是加一些晶種，提供一些生長位點，降低結(jié)晶的能壘。另外可以添加一些添加劑或者結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)誘導(dǎo)目標(biāo)多晶型的形成。

多晶型的表征

在藥物結(jié)晶時如何判斷它是不是多晶型呢？下圖（圖8）是兩個氨基酸不同的晶體形狀，在做結(jié)晶時最直觀的是在顯微鏡下觀察，這兩個一個呈針狀、一個呈片狀。阿斯巴甜的兩個晶習(xí)也是針狀和棒狀，棒狀占到一半。

圖8.阿斯巴甜與苯丙氨酸的不同晶習(xí)

如何判斷內(nèi)部分子是否真的有不同的排列，最基本的檢測是做 X 射線衍射即XRD。通過XRD，如果它有一些新的衍射峰，就會知道它是不一樣的晶型；此時再做一些熱力學(xué)分析，如TGA、DSA。TGA是熱失重分析檢測，熱失重是來幫助我們判斷里面是不是溶劑化合物、有沒有溶劑流失； DSA 是差熱檢測，會告訴我們隨著溫度的變化它的吸熱、放熱過程，可以幫助判斷它的熔點在哪以及里面是否有溶劑或水的散失。另外我們還會采用光譜研究，如紅外或拉曼來看是否形成新的鍵或鍵與鍵的振動變化；核磁共振可應(yīng)用觀察內(nèi)部的構(gòu)象變化。除DSA 之外，還可以用專門的熔點儀測定它的熔點，因為不同晶型的熔點有時也會有差異，但并不是所有的熔點都會有很大差異。在申報新藥時就提到了對晶型研究的一些要求，比如必須要提供詳細(xì)的制備不同晶型的方法、理化性質(zhì)的差異以及各種晶型的相互轉(zhuǎn)換。

多晶型的篩選

如果想要研究到底有沒有多晶型或多晶型之間是如何轉(zhuǎn)換的，我們一般會做一些預(yù)實驗看它形成多晶型的趨勢是怎么樣。如果我們發(fā)現(xiàn)了一些熱力學(xué)穩(wěn)定的晶型，就會篩選更合適的條件以及做一些放大生產(chǎn)。

多晶型的轉(zhuǎn)化主要有兩大類，包括溶液介導(dǎo)轉(zhuǎn)晶和固態(tài)轉(zhuǎn)晶。下圖（圖9）是時間的分布圖，從右到左是從秒升到月，可以看到介穩(wěn)晶型比較快出來。在大部分研究中用的是溶液介導(dǎo)轉(zhuǎn)晶的方法；在溶液介導(dǎo)轉(zhuǎn)晶中，可以用蒸發(fā)結(jié)晶、冷卻結(jié)晶以及反溶劑結(jié)晶，反溶劑是加入一些溶劑。不同的結(jié)晶方式都是提升過飽和度后提出晶體，因為過飽和度是結(jié)晶最主要的推動力。下圖（圖9）右邊列出的一些方法都可以用來進行多晶型的研究，如溶液結(jié)晶；還可以把一些溶劑化合物或水合物進行脫溶劑或脫水；熔融結(jié)晶也會經(jīng)常研究，這就是固態(tài)轉(zhuǎn)晶。其次可以添加晶種、做懸浮的重結(jié)晶或改變外部環(huán)境如采用毛細(xì)管、激光或超聲的方式結(jié)晶；還可以通過添加添加劑來促進晶種結(jié)晶。

圖9. 多晶型的轉(zhuǎn)化及篩選

除此之外還有很多模擬軟件可以幫助我們進行多晶型的結(jié)構(gòu)預(yù)測，我們正在與帝國理工大學(xué)的一個軟件模擬組進行合作，他們在做關(guān)于多肽的整體結(jié)構(gòu)預(yù)測，但剛做到二肽和三肽，所以晶型預(yù)測的路還很長。如果想制備亞穩(wěn)晶型，最常用的方法是在高過飽和度的溶液中加入大量介穩(wěn)晶型的晶種。還有一個方法是雅培公司在進行晶型Ⅰ研發(fā)時發(fā)現(xiàn)的反滴法，即反向的反溶劑的方法，是把晶種先加到反溶劑中懸浮，緩慢滴加API溶液。

小分子藥物的結(jié)晶研究

藥物結(jié)晶不僅僅是研究多晶型，還有很多的研究聚焦于提高純度、縮短誘導(dǎo)期以及改變晶習(xí)等，這些在生產(chǎn)中都至關(guān)重要。

大分子生物醫(yī)藥中的結(jié)晶

多肽的結(jié)晶

所謂多肽是比蛋白質(zhì)更短的介于小分子與蛋白質(zhì)之間的多肽鏈，多肽的氨基酸總數(shù)小于 50 個氨基酸殘基。在市場上，多肽藥物也正在研發(fā)，但只有很少一部分采用了固體制劑；大部分的分離方法還是液相色譜分離方法，尤其是需要通過注射的方式來進入人體體內(nèi)的胰島素。目前我們正在探索采用固體形式結(jié)晶多肽藥物的方法，這樣藥物服用體驗感也會更好。

在大分子結(jié)晶方面，除了工業(yè)生產(chǎn)上，多肽的結(jié)晶以及蛋白質(zhì)結(jié)晶對結(jié)構(gòu)學(xué)也有很大幫助，可以通過晶體結(jié)構(gòu)了解配體跟受體之間的相互作用力、如何與靶點作用。多肽、蛋白質(zhì)以及小分子的構(gòu)象是不同的，長鏈導(dǎo)致它在溶液里比較靈活。多肽結(jié)晶現(xiàn)在面臨的主要問題是構(gòu)象比較靈活、成核機理不明確、原料藥量少且昂貴。

最常用的大分子結(jié)晶是蒸汽擴散法，分為懸滴法和坐滴法；批量生產(chǎn)現(xiàn)在已經(jīng)有自助儀器可以分析篩選幾百個不同的條件，找到在哪種條件下合適生長，這就是單晶生長即養(yǎng)單晶的過程。另外 Microbatch 的方法也是相似的，優(yōu)點是加了一層油封起來，可以防止液滴揮發(fā)。還有一些新的方法，比如外消旋結(jié)晶是加入了不同手性的物質(zhì)結(jié)合到一起，類似于共晶的性質(zhì)；共晶是多肽，如果難以結(jié)晶，可以把它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成共晶。與小分子相似的是，可以用模板法或加入電場、超聲等。也可在酶蛋白中加入一些模板劑，縮短誘導(dǎo)期。

因為多肽結(jié)晶的機理不是特別明確，所以我們現(xiàn)在是打算從一個、兩個、三個的短肽開始做。主要研究方向分為三個部分，一部分是熱力學(xué)性質(zhì)的研究，因為不飽和度、誘導(dǎo)期等的計算都需要用到溶解度；其次是動力學(xué)研究，最后是針對于它的一些靈活構(gòu)象。本次主要分享熱力學(xué)研究以及構(gòu)象部分的研究進展。

在溶解度方面，可以看到不管是小分子還是大分子都有自己的溶解度曲線；可以根據(jù)不同的溶解度、不同的走向設(shè)計實驗；比如小分子的溶解度隨著溫度的變化很明顯，就可以用冷卻結(jié)晶的方法；如果變化不明顯，就要考慮它是不是在反溶劑添加過程中的溶解度有很大變化，從而采用反溶劑結(jié)晶。

圖10. 溶解度

上圖（圖10）是蛋白質(zhì)的溶解度，可以看到它的影響因素會更多一點，里面包括了Ph值的變化以及緩沖溶液、鹽的成分對溶解度的影響。在我們現(xiàn)在的研究中，首先采取了最簡單的氨基酸——Glycine，讓它形成了不同的同質(zhì)多肽，是不同鏈長的Glycine，可以通過測定溶解度觀察鏈長對Glycine的影響。另外，因為Glycine的側(cè)鏈只是氫，我們還將與不同的氨基酸結(jié)合來考察側(cè)鏈對二肽溶解度的影響。我們采取了靜態(tài)法和動態(tài)法測定溶解度，從結(jié)果上來看，鏈越長，對于Glycine的homopeptides，它的溶解度逐漸降低。在對于側(cè)鏈的溶解度研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同的側(cè)鏈對溶解度的促進作用是不一樣的，比如加入Glycine后可以提高二肽的溶解度；如果加的是Phenylalanine會使二肽的溶解度降低。

利用SAFT-γMie進行多肽分子的溶解度預(yù)測

在研究了一系列氨基酸和多肽溶解度后，我們想用的方法是統(tǒng)計締合流體理論——SAFT-γMie，是與帝國理工大學(xué)Amparo Galindo 教授等合作的，他們是這個方法的開創(chuàng)者，他們用這個方法預(yù)測氣-氣與氣-固的熱力學(xué)性質(zhì)，預(yù)測效果不錯。所以我們就想能否把這個方法應(yīng)用到多肽中？因為這個方法的核心是基團貢獻法的概念，把一個分子分成不同的基團。多肽是重復(fù)的結(jié)構(gòu)，如Glycine的多肽都有氨基、羧基。分割來看，包含了像下面表格列出的不同基團都是重復(fù)的作用；把相互之間的作用列成表，我們需要做的是知道每一個不同基團之間的相互作用，再提供新的多肽就無需了解多肽其他信息，就可以直接通過結(jié)構(gòu)預(yù)測多肽的熱力學(xué)性質(zhì)。

下圖（圖11）左下角是我們通過Glycine的溶解度等數(shù)據(jù)得到的一些結(jié)果。溶解度、熱力學(xué)性質(zhì)的數(shù)據(jù)越多，擬合出的參數(shù)會更加準(zhǔn)確。通過擬合出來的參數(shù)預(yù)測了其他有相似基團的氨基酸，預(yù)測發(fā)現(xiàn)溶解度的效果不錯。但是對于多肽而言，需要更多的參數(shù)，下表中深藍色部分是已知參數(shù)，淺灰色是數(shù)據(jù)庫中還不存在的。這些基團存在于多肽是比較廣泛的，所以現(xiàn)在的難點是得到全部參數(shù)，這就需要大量實驗。但是對于多肽，除了這些參數(shù)，還需要用到物質(zhì)的熔點；熔點的預(yù)測也是比較困難的。德國的一個課題組用高速 DSA 測量熔點，至于多肽的熔點為什么難測量，是因為用普通的 DSA 測量熔點時，它的熔融峰和分解峰會邊熔化邊分解導(dǎo)致這兩個峰重合，因此很難得到最后的熔融晗。熔融晗和熔點是這個方法中很重要的兩個物理化學(xué)性質(zhì)，也是目前我們想用實驗測量的。

圖11.利用SAFT-γMie進行多肽分子的溶解度預(yù)測

非折疊構(gòu)象和結(jié)晶的關(guān)系

關(guān)于多肽結(jié)晶，我們在做關(guān)于構(gòu)象和結(jié)晶條件的研究。構(gòu)象中大部分蛋白質(zhì)都是折疊的，折疊蛋白質(zhì)中主要的兩個二類結(jié)構(gòu)是α-helix和β—sheet ，有很多部分是有非折疊的區(qū)域，還有一些蛋白質(zhì)、多肽完全沒有折疊的部分。以前科學(xué)家們可能認(rèn)為二類結(jié)構(gòu)是完全無序的，沒有任何規(guī)則的二面角。在檢測手段提升后，人們發(fā)現(xiàn)在非折疊的結(jié)構(gòu)中經(jīng)常出現(xiàn)一個叫pPⅡ helix二面角經(jīng)常出現(xiàn)于Glycine、Alanine、Proline 這三個氨基酸形成的短鏈多肽里面。這個結(jié)構(gòu)也經(jīng)常出現(xiàn)在一些多肽的尾端或α-helix 與β-sheet 中間的連接端。為什么多肽這么難結(jié)晶出來，是不是因為尾端或者連接端的構(gòu)象比較靈活，所以我們就對這一部分的構(gòu)象進行研究，選擇研究不同鏈長的Glycine。

之前科學(xué)家通過大量的模擬手段發(fā)pPⅡconformation，后來發(fā)現(xiàn)pPⅡ conformation相對于α-helix、β—sheet更加穩(wěn)定；但爭論是不明確它是如何穩(wěn)定存在在水里的。于是在一系列的結(jié)晶研究后發(fā)現(xiàn)Triglycine即三肽可以在水中形成水合物，水合物是水分子與絡(luò)合物的羧基等結(jié)合，找到結(jié)合位點后可以知道構(gòu)象是怎么在水里穩(wěn)定的。后面的研究中通過改變不同的結(jié)晶條件，了解非折疊的構(gòu)象和折疊的構(gòu)象是怎么變化，希望可以對后面的長鏈多肽的靈活構(gòu)象帶來啟發(fā)。

目前發(fā)現(xiàn)了一定趨勢，但是我們現(xiàn)在還在研究一些內(nèi)部原因，我們在做關(guān)于 PH 值的測定，想發(fā)現(xiàn)不同的條件中會不會有統(tǒng)一的因素導(dǎo)致非折疊構(gòu)象變成折疊構(gòu)象。溶液里的檢測，比如溶液里它在某些條件下是非折疊的，和最后的固體晶體的結(jié)構(gòu)相一致，在同樣的條件下生產(chǎn)出來的固體具有相同構(gòu)象。溶液里的構(gòu)象對于短鏈多肽有很大作用。

這就是我想給大家分享的內(nèi)容。希望大家可以多多提問、多多交流。這是我的郵箱m.guo17@imperial.ac.uk，大家可以給我發(fā)郵件交流。

提問與回答：

Q1：可以講一下晶習(xí)和晶型的區(qū)別嗎？

答：晶習(xí)是晶體外面的形貌，是在顯微鏡下觀察到的外部形狀，就稱之為晶習(xí)即crystal habit ；晶型是crystal structure。晶習(xí)雖然有針狀、片狀，但是不能確定是不同的晶型，因為不同的晶體形狀可能有相同的晶體結(jié)構(gòu)；只是在生長的過程中可能有溶劑附著到某個晶面上，導(dǎo)致晶面不能生長變成了片狀或針狀。所以晶習(xí)是外部形狀。

Q2：剛剛提到多肽藥物現(xiàn)在大部分是注射劑型，如果是做成可以口服的固體，你了解現(xiàn)在哪些藥物是口服有效的，比如多肽可能在胃液中降解或被一些蛋白酶降解成氨基分子。

答：這個問題很好。胰島素是降低血糖，但機制有很多種；有的是促進體內(nèi)胰島素的生成；有的可能是促進胰島素生成的物質(zhì)的生成；所以胰島素藥物的研究有很多種?，F(xiàn)在已經(jīng)有少量的胰島素藥物可以口服。我們還在研究一些其他研發(fā)路線的液體胰島素藥物晶型的生成。這是比較有開創(chuàng)性的。

Q3：剛剛提到你們想預(yù)測比如說短肽晶型可以利用短肽的各種小的結(jié)構(gòu)比如重復(fù)性的基團如氨基、羧基或中間的肽鍵。因為別的組在做預(yù)測，不知道你了不了解這個預(yù)測模型里面輸入的數(shù)據(jù)是除了這些基團的相互作用以外，還有其他的嗎？還是只是二維的數(shù)據(jù)如哪些基團和哪些基團有沒有相互作用？

答：這其實有一個公式的，公式顯示是通過計算它的化學(xué)勢能；溶解度是固液的平衡狀態(tài)，所以固體的化學(xué)式跟液體的化學(xué)式是相等的?；瘜W(xué)式的計算是通過一系列的參數(shù)，包含了如基團的一些斥力、引力以及相互作用力的參數(shù)因子。有了這些參數(shù)，經(jīng)過一些計算就可以知道固體的化學(xué)勢能。除了這些參數(shù)，其他的就是熔融晗以及熔點。

Q4：請問有什么實驗小技巧能夠提高單晶形成率？

答：單晶形成率的關(guān)鍵在于能否提供很穩(wěn)定的環(huán)境。有時在同樣條件下，換了一個實驗室后可能就長不出來了。實驗小技巧可能是盡量保證環(huán)境是穩(wěn)態(tài)的環(huán)境，稍有改變可能就會影響成核，所以盡量控制穩(wěn)態(tài)的存在?？刂普羝麛U散是一個很慢的過程，如果不是很慢，就很難形成。

Q5:可以評論一下GLP-Ⅰ結(jié)晶性質(zhì)嗎？

答：GLP-Ⅰ 結(jié)晶放了這張圖片，是因為我們正在做一個和禮來合作的項目，他們在做一些胰島素藥物，那個多肽類似于GLP-Ⅰ。但是在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫里查詢GLP-Ⅰ 多肽后，發(fā)現(xiàn)GLP-Ⅰ 無法單獨形成結(jié)晶，而是與受體共同形成的共晶，所以現(xiàn)在沒有形成它的結(jié)晶條件。但是GLP-Ⅰ 結(jié)構(gòu)是可以知道的，可以用NMR檢測出結(jié)構(gòu)。我們在做的多肽研究一開始用了大量的商業(yè)化kit篩選結(jié)晶條件，結(jié)果表明一些kit里面可以長出單晶。取單晶時，因為單晶很小，所以要專門的比較高端的設(shè)備去測，我們發(fā)現(xiàn)有一些疑似晶體但沒有測出衍射峰，這也是后續(xù)我們想要調(diào)控的方面。我們已經(jīng)用了大量的商業(yè) kit 去做，現(xiàn)在打算提升一下，用懸滴法，我們實驗室也有一些半自動化的設(shè)備，做一些稍微多一點容量的結(jié)晶，比如1 毫升微型結(jié)晶方法去檢測更多的在那個條件下相似的一些如buffer 的性質(zhì)或調(diào)節(jié) Ph值。希望可以做出來關(guān)于多肽的結(jié)晶條件。

圖12.GLP-Ⅰ

Q5：請問蛋白晶體為什么沒有衍射點？有什么改進的方法嗎？

答：晶體比較小，對儀器有很高的要求。我們也在進行改進，蛋白結(jié)晶相當(dāng)于優(yōu)化單晶生長的過程。