北卡羅來納大學(xué)教堂山分校、國(guó)立衛(wèi)生研究院等機(jī)構(gòu)的研究人員開發(fā)出一種基于CRISPR-Cas9的系統(tǒng)，可以利用化學(xué)表觀遺傳修飾因子（CEM）來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的激活，而無需使用外源的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。

這項(xiàng)成果于本周發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上。此系統(tǒng)由兩部分組成，其一是帶有FK506結(jié)合蛋白（FKBP）的催化失活Cas9（dCas9），其二則是CEM，它可以招募內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，從而激活目標(biāo)基因的表達(dá)。

作者寫道：“我們證明，CEM可以使內(nèi)源位點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)20多倍。我們還證明了轉(zhuǎn)錄激活的劑量依賴性控制、在多個(gè)不同基因上的作用、CEM活性的可逆性以及我們最佳的CEM在整個(gè)基因組中的特異性。”

在之前的研究中，科學(xué)家證明了CEM能夠修飾染色質(zhì)并抑制改造位點(diǎn)的基因表達(dá)。在這項(xiàng)新研究中，他們開發(fā)出CEM激活（CEMa）分子，可以招募內(nèi)源性基因激活機(jī)制，包括CEM87、CEM88和CEM114。這些分子分別與不同的轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合。

為了檢驗(yàn)基因表達(dá)的變化，研究人員利用綠色熒光蛋白（GFP）基因轉(zhuǎn)染了HEK293T細(xì)胞，并對(duì)共表達(dá)gRNA和dCas9機(jī)制的細(xì)胞開展流式分析。他們用共表達(dá)dCas9-FKBP×1或dCas9-FKBP×2以及CEMa分子的質(zhì)粒激活報(bào)告基因。在48小時(shí)后，他們發(fā)現(xiàn)GFP報(bào)告基因的表達(dá)均有顯著增強(qiáng)。

在優(yōu)化dCas9系統(tǒng)后，研究人員選擇了兩個(gè)最有效的CEMa分子（CEM87和CEM114）開展時(shí)間進(jìn)程分析。他們用表達(dá)dCas9、MS2-FKBP×2和GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。與未處理的細(xì)胞相比，經(jīng)過CEM87和CEM114處理的細(xì)胞在24小時(shí)和48小時(shí)后產(chǎn)生了GFP高表達(dá)。他們還發(fā)現(xiàn)，CEM對(duì)目標(biāo)基因的激活調(diào)控是可逆的。

為了研究dCas9-CEMa系統(tǒng)的多功能性，研究人員利用靶向白介素1受體拮抗基因（IL1RN）的gRNA進(jìn)行了測(cè)試。與對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)過CEM87處理后，IL1RN基因的表達(dá)增強(qiáng)了近96倍。同時(shí)，他們還靶向了表達(dá)量相對(duì)較高的MYC1位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CEM87并未明顯增強(qiáng)其表達(dá)。

作者總結(jié)道：“通過CEMa技術(shù)與dCas9載體的融合，我們理論上可以通過該系統(tǒng)來靶向基因組中的任何基因。這種dCas9-CEMa技術(shù)為靶向疾病相關(guān)的基因鋪平了道路，有望解答與疾病機(jī)理相關(guān)的問題?！?/p>