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由于缺乏準確復制人類骨髓復雜性的合適模型，阻礙了我們對正常和癌癥血細胞發(fā)育的理解和新療法的測試。

今天小學社為大家?guī)淼倪@篇28分的文章中，研究人員描述了一種從誘導多能干細胞中產生骨髓類器官的方法，該方法模仿了人類骨髓的關鍵特征。該類器官成功地支持了來自血液惡性腫瘤患者的細胞的生長和生存，使它們成為研究血液惡性腫瘤和骨髓疾病的潛在工具。一起來學習一下吧！

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骨髓微環(huán)境在維持和調節(jié)血細胞的產生方面起著關鍵作用。這種微環(huán)境的破壞會導致血液腫瘤和骨髓衰竭的發(fā)生。然而，在人類疾病的背景下建立這些功能障礙的模型是具有挑戰(zhàn)性的，因為目前的體外和動物模型在準確再現(xiàn)骨髓復雜的相互作用和成分方面有局限性。目前急需改進體外培養(yǎng)系統(tǒng)，以更好地了解造血和骨髓惡性腫瘤的機制。

研究人員旨在開發(fā)一個類似人類骨髓的類器官，模仿骨髓的結構和功能，支持造血細胞的生長和存活。這個由誘導多能干細胞（iPSC）生成的類器官系統(tǒng)為研究疾病機制、藥物開發(fā)和減少對動物模型的依賴提供了一個可擴展和可操作的模型。研究人員對該類器官使用成像技術和單細胞RNA測序進行了驗證，它們成功地支持了健康和惡性造血細胞的共培養(yǎng)，允許篩選潛在的骨髓纖維化抑制劑。

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1. 含I型和IV型膠原的混合基質水凝膠能夠促進骨髓類器官的血管網(wǎng)絡形成

在這項研究中，研究人員優(yōu)化了培養(yǎng)方案，使用了人類誘導多能干細胞（iPSC）和含有基質膠的混合基質水凝膠。首先，iPSC形成聚合體，然后這些聚合體被嵌入到水凝膠中以誘導血管生長。12天后，收集和培養(yǎng)新芽以形成骨髓類器官（圖1A-B）。在生成血管化的人類骨髓類器官的背景下，研究人員比較了不同水凝膠成分對基質、內皮和骨髓系統(tǒng)形成的影響。他們發(fā)現(xiàn)，同時含有I型和IV型膠原蛋白的混合基質水凝膠能夠導致類器官具有更大的骨髓細胞和間充質干細胞（MSC）種群（圖1C-D）。

此外，研究人員通過測量內皮細胞的萌芽來評估類器官的血管化，發(fā)現(xiàn)與I型和I+IV型膠原蛋白水凝膠相比，IV型膠原蛋白水凝膠的萌芽半徑較小，某些內皮細胞標記物的密度較低。共聚焦成像顯示，整個器官中存在復雜的血管網(wǎng)絡，其中有造血干細胞、巨核細胞和紅細胞與內皮細胞緊密相連，類似于人體骨髓的結構（圖1E-J）。

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圖1

2. VEGFC能夠誘導類器官中的血管特化為骨髓竇狀體的表型

在使用膠原蛋白I型和IV型混合基質水凝膠成功生成3D血管網(wǎng)絡后，研究人員旨在優(yōu)化生長因子的支持，以創(chuàng)建類似于骨髓竇的類器官脈絡。他們測試了在血管萌芽階段添加VEGFC的效果，VEGFC是一種參與血管形成的關鍵生長因子。添加VEGFC導致FLT4（VEGFR3）、粘附分子和與HSPC相關的生長因子的表達增加，表明在器官中誘導出了類似骨髓的血管表型，通過免疫染色得到證實（圖2A-C）。

研究人員還研究了巨核細胞與竇狀內皮的關聯(lián)，它們將原血小板延伸到血管腔內，最終在剪切力作用下產生血小板芽。骨髓的冷凍切片及免疫熒光染色被用來支持這些觀察（圖2D-I）。

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圖2

3. scRNA-seq證實類器官內的造血細胞和基質細胞與人類造血組織具有轉錄同源性

為了將類器官的細胞類型和分子譜與人類造血組織進行比較，研究人員對類器官的細胞進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）。這項分析揭示了關鍵造血和基質細胞亞型的不同群體，包括HSPC、紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、巨核細胞、嗜酸細胞/嗜堿細胞/肥大細胞、成纖維細胞、內皮細胞和間質細胞。還確定了與這些細胞類型相關的特定基因的表達，提供了對器官的組成和特征的深入了解（圖3A-C）。使用力導向圖（FDG）進行的軌跡分析顯示，骨髓類器官中的細胞表現(xiàn)出造血髓系分化的三種主要路線，與在人類骨髓中觀察到的情況相似。

此外，對基質細胞群的分析顯示，內皮細胞和間充質干細胞/成纖維細胞的分化路線不同，這與基于以往知識的預期一致（圖3D-E）。為了評估骨髓類器官和人類造血組織的相似性，研究人員將類器官的基因表達譜與成人骨髓和胎兒肝臟和骨髓的現(xiàn)有scRNA-seq數(shù)據(jù)集進行了比較。分析顯示，類器官衍生的細胞與人類骨髓中發(fā)現(xiàn)的各種細胞類型之間存在明顯的重疊，包括HSPC、骨髓亞群、成纖維細胞/MSC和內皮細胞（圖3F）。

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圖3

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4. 骨髓類器官再現(xiàn)造血細胞、內皮細胞和基質細胞之間的細胞和分子相互作用

研究人員調查了人類骨髓類器官內不同類型細胞之間的細胞和分子相互作用。類器官中細胞的基質支持元素，如間充質干細胞和成纖維細胞，顯示出與人類骨髓中的對應細胞非常相似，表明有高度的轉錄相似性（圖4A-C）。他們分析了受體和配體的表達，并確定了造血細胞和基質細胞區(qū)間內部和之間的復雜通信網(wǎng)絡。結果顯示，MSC、成纖維細胞、內皮細胞和單核細胞之間有很強的自分泌和旁分泌相互作用，突出了器官中這些細胞亞型之間復雜的相互作用。

為了研究在骨髓類器官的分化過程中加入VEGFC的效果，研究人員比較了只用VEGFA和VEGFA+C處理的類器官所產生的內皮細胞的基因表達譜。他們發(fā)現(xiàn)，來自VEGFA+C類器官的內皮細胞表現(xiàn)出更高的與骨髓竇道內皮相關的標記物的表達。此外，VEGFA+C類器官中的其他細胞亞群顯示出關鍵調節(jié)途徑的上調，包括TGF-β1信號傳導和CXCL12信號傳導（圖4D-H）。

上述結果表明骨髓類器官基質中的造血細胞和基質成分之間的交流網(wǎng)絡在患者骨髓中發(fā)現(xiàn)的類似。在類器官基質細胞中檢測到的造血支持因子在蛋白質水平上的表達證實，類器官自然分泌多種生長因子，可以支持造血，而不需要外部提供細胞因子或生長因子（圖4I-J）。

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圖4

5. 骨髓類器官模擬血液腫瘤中出現(xiàn)的TGF-β誘導的骨髓纖維化，為抑制劑的篩選提供體外平臺

病理性的造血機制重塑是多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中常見的現(xiàn)象，會導致骨髓纖維化。這種纖維化是由造血細胞產生過多的促纖維化細胞因子，特別是TGF-β引起的，導致膠原蛋白和網(wǎng)狀蛋白纖維在骨髓基質中沉積。在這項研究中，研究人員通過用不同劑量的TGF-β處理類器官，研究類器官是否能模擬病理性的骨髓纖維化，結果發(fā)現(xiàn)TGF-β處理導致纖維化標志物的表達增加，膠原蛋白沉積和血管化減少，類似于在骨髓纖維化患者身上觀察到的變化（圖5A-G）。

研究人員調查了兩種潛在抑制劑SB431542和JQ1在治療骨髓類器官纖維化方面的有效性。他們發(fā)現(xiàn)，這兩種化合物都能抑制可溶性IL11的表達，這是纖維化的一個標志物，并使ACTA2和COL1A1的過表達正?；@與成纖維細胞的激活有關。這些發(fā)現(xiàn)表明，骨髓類器官可以作為研究和篩選治療惡性骨髓纖維化的潛在藥物的寶貴模型（圖5H-J）。

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圖5

6. 與來自骨髓纖維化患者的細胞共培養(yǎng)后出現(xiàn)類器官纖維化現(xiàn)象

在建立了與患者骨髓的相似性之后，研究人員假設，這些類器官可以支持來自血液惡性腫瘤患者的原始細胞的共培養(yǎng)。這將允許對癌細胞和周圍基質之間的相互作用進行建模，并有可能進行個性化的細胞毒性篩選。結果顯示，共培養(yǎng)表現(xiàn)出可溶性TGF-β水平的升高，膠原蛋白I和αSMA的表達增加，表明發(fā)生了纖維化。此外，在共培養(yǎng)模型中，內皮細胞相關基因和血管的表達也有所下降（圖6A-I）。患者來源的CD34陽性HSPC在骨髓類器官內進行共培養(yǎng)。14天后，類器官中的細胞亞群顯示出骨髓分化，不同的免疫表型表明紅細胞、骨單核細胞和巨核細胞的發(fā)展（圖6J）。

研究人員將來自骨髓纖維化患者的細胞與類器官共培養(yǎng)，以篩選潛在的纖維化抑制劑。他們用不同的抑制劑處理類器官，發(fā)現(xiàn)只有JQ1能將纖維化標志物COL1A1的表達恢復到正常水平，并明顯減少另一種纖維化標志物αSMA。這些發(fā)現(xiàn)表明，JQ1可能是治療骨髓纖維化患者纖維化的一個潛在治療選擇（圖6K-M）。

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圖6

7. 骨髓類器官支持一系列血液惡性腫瘤原代細胞的移植、存活和增殖

研究人員比較了不同類型的癌細胞（多發(fā)性骨髓瘤、ALL和Xeno iALL）在類器官中的生存和生長情況。他們發(fā)現(xiàn)，與在液體培養(yǎng)基或三維共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的細胞相比，移植在類器官中的癌細胞顯示出明顯更高的活力和增殖率。此外，類器官保持了來自骨髓瘤患者的漿細胞的原始特征，表明了它們作為研究造血和癌癥模型的潛力（圖7）。

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圖7

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綜上所述，在這項研究中，研究人員開發(fā)了一種方法來創(chuàng)建血管化的骨髓類器官，準確地模仿了骨髓的細胞和分子特征。這些有機體可被用于模擬骨腫瘤的相關變化和骨髓纖維化。這項研究為了解癌癥對骨髓環(huán)境的影響提供了一個寶貴的工具。

參考文獻：

Khan AO, Rodriguez-Romera A, Reyat JS, et al. Human Bone Marrow Organoids for Disease Modeling, Discovery, and Validation of Therapeutic Targets in Hematologic Malignancies. Cancer Discov. 2023 Feb 6;13(2):364-385.

來源：類器官學社