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人源結(jié)直腸癌類器官是一種基于結(jié)直腸癌患者來源腫瘤細胞搭建的體外三維模型，通過引入細胞外基質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子以及小分子化合物等，在體外模擬結(jié)直腸癌細胞的生長微環(huán)境，促使患者來源腫瘤細胞自我增殖并組裝成結(jié)直腸癌類器官。這種模型與結(jié)直腸腫瘤組織在細胞特性、分子特征和異質(zhì)性等方面高度相似，可實現(xiàn)體外長期培養(yǎng)和使用，成為新型結(jié)直腸癌研究模型，補充了結(jié)直腸癌細胞系和異種移植模型的不足。

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1、儀器

CO2培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、低溫水平式離心機、低溫冰箱

2、材料

細胞培養(yǎng)板(規(guī)格為 24孔、48孔和96孔)、離心管(規(guī)格為 1.5mL、15mL和50mL)、細胞培養(yǎng)皿 (直徑規(guī)格為 2.5cm和 6cm) 、移液器 (規(guī)格為 2.5μL、10μL、20μL、200μL、1000μL)、無菌吸頭 (規(guī)格為 10μL、200μL、1000μL )、無菌鑷子、無菌組織剪、細胞過濾器 (濾網(wǎng)孔徑為 70μm 和 100μm)、基質(zhì)膠培養(yǎng)基、無菌含有雙抗的冰PBS

3、操作流程

①組織樣本預處理

在超凈臺內(nèi)，將組織從原代組織保存液中取出，放入無菌培養(yǎng)皿中，用含有雙抗的PBS抽吸沖洗15遍后，放置于盛有組織緩沖液的無菌培養(yǎng)皿中，對樣本進行試驗前狀態(tài)記錄。

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使用無菌鑷子盡可能清理掉所有壞死組織及非上皮組織（例如肌肉或脂肪、結(jié)締組織），在培養(yǎng)皿或離心管中用無菌的剪刀/手術(shù)刀，對樣本進行機械分離，將大塊的組織分離成為大約0.5-2 mm3?的細小碎片或糊糜狀。（剁碎至組織不卡1mL槍頭為最佳）

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②消化液消化-終止

將經(jīng)過剁碎好的組織，完全轉(zhuǎn)移至 15 mL 無菌離心管中，并加入50倍剪碎組織懸液體積的組織消化液重懸，用 1 mL 槍頭輕輕吹打組織，使其充分分散；將含有該消化液的離心管放置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱，37℃?條件下，1200 rpm 的轉(zhuǎn)速消化分離20-40分鐘，每隔10min均勻取10μL懸液到96孔進行鏡檢觀察，觀察到有大量的類器官形態(tài)的細胞團塊則即可終止消化。

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在消化完成的組織懸液中加入胎牛血清至終濃度達2%-4%以減緩消化作用，同時輕輕吹打10次以上。用 100μm的篩網(wǎng)將細胞懸液過濾進入新的15mL離心管中，用無菌 PBS 清洗篩網(wǎng)。

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③細胞洗滌

將上述含有細胞濾液的離心管在4℃，1,200 rpm 條件下離心 3 min，小心去除上清。沉淀細胞用 PBS 清洗一次；向細胞沉淀中加入適量的細胞培養(yǎng)液，輕輕吹打制成單細胞懸液，4℃，1,200 rpm 條件下離心 3 min。

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④原代組織樣本細胞活力檢測

取少量終止消化后的細胞懸液進行原代組織樣本質(zhì)量檢測(一般選用臺盼藍計數(shù)染色，總細胞活力大于90%以上且總細胞量在104以上表明該原代組織樣本質(zhì)量良好)。

⑤基質(zhì)膠3D包裹

檢測剩余細胞懸液，于 200~300g離心力離心 3-5分鐘，吸去上清液保留沉淀，按每孔8000-10000個細胞對應20-30μL基質(zhì)膠的比例計算加入相應量的類器官基質(zhì)膠(以24 孔板為例)，并在冰上混勻(注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡常溫混勻則需要控制在 15 秒內(nèi)) ，混勻后置于冰上。

注意：為確保培養(yǎng)過程中類器官基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，應保持基質(zhì)膠的體積比在70%以上。

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⑥種板培養(yǎng)

用移液器吸取基質(zhì)膠和細胞的混合液移至細胞培養(yǎng)孔板中，(如 24 孔細胞培養(yǎng)板每孔點20 ~30μL混合懸液），混合懸液須點至培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中凝固30分鐘。待基質(zhì)膠凝固至不再流動后，沿孔壁緩緩加入完全培養(yǎng)基（以24孔為例，加500μL完全培養(yǎng)基），將24孔板置于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天更換一次完全培養(yǎng)基。

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⑦組織類器官觀察

將細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天觀察類器官并拍照，了解初始類器官數(shù)量、增殖速度、形態(tài)、微生物污染情況等。

本文來源：類器官學社、盛合瑞生物