我要的是全長蛋白，怎么還有截短的產(chǎn)物，這是怎么回事？

1. 一個最直接原因就是蛋白水解了。 2. 然而第二點翻譯起始也非常有可能。起始密碼子AUG (Met) 的上游在RNA編碼區(qū)有類似于核糖體結(jié)合位點序列 (AAGGAGG)的間隔序列(通常是5–13個核苷酸)時，容易出現(xiàn)這種問題。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成 麻煩。解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標簽的pET載體，例如pET-28和pET-30系列載體在N-端和C-端都有 His-Tag。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開。pET-29和pET-30系列 載體在N-端融合有HiS-Tag序列而C-有His-Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His- Bind樹脂親和純化以獲取全長蛋白。

His標簽包在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部還能用蛋白酶切除嗎？

一般重組蛋白純化標簽被包在內(nèi)部，可以增加所提的蛋白質(zhì)樣品的溶解度，比如適量增加變性試劑濃度或類型使得蛋白質(zhì)的肽鏈松散開暴露出（組氨酸）6標簽。另外，還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型，加大DTT濃度（DTT濃度<1mmol/L，否則DTT會與Ni

2+

結(jié)合），適當調(diào)整調(diào)高鹽濃度（氯化鈉溶液低于2mol/L，從低濃度到高濃度逐漸分梯度上升），總之，作用就是增加蛋白質(zhì)的可溶性，因為his6的親水性較強，增加可溶性之后his6容易暴露在水相。加大DTT濃度也可以切斷二硫鍵使得蛋白質(zhì)的肽鏈松散，進而使his6容易暴露在水相，從而方便純化和酶切。再者重新構(gòu)建，不加His-tag。

目的蛋白大于100kd或含有多個亞基，是否可以用原核表達系統(tǒng)？

在細菌中已經(jīng)非常成功底表達了很多大蛋白。多亞基復(fù)合物則可以通過分別表達各亞基，然后在有尿素的溶液中，將各組分以適當比例混和，再透析除去變性劑。

是否所有的位點特異性蛋白酶都有一樣的酶切特性，只是識別位點不同？

位點特異性蛋白酶(例如凝血酶、腸激酶和Xa因子)通常被用來切割融合蛋白。這些酶的活性和第二點酶切傾向性很不相同。凝血酶在這三種中是特異性活性最高的，能夠有效切質(zhì)量比僅為1:2000的蛋白。Xa因子似乎對于切點周圍的序列很敏感，經(jīng)常會出現(xiàn)特異性位點切割不理想?yún)s發(fā)生別的位點被切割的情況。腸激酶的專一性是上述三種中最好的，但由于切割效率低（通常要求質(zhì)量比達到1:10）而顯得比較昂貴。另一個需要考慮的問題是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在質(zhì)量比比較高的酶切反應(yīng)進行完后，通常要通過色譜法處理。比較方便可行的方法是采用生物素化凝血酶結(jié)合鏈親和素瓊脂糖一起 使用。盡管沒有一種蛋白酶完美無缺，凝血酶還算的上是活性高、專一性好的典型。

如果去除信號肽，會不會影響蛋白本身的表達？

蛋白表達強度不受信號肽調(diào)控，所以去除信號肽不會影響蛋白質(zhì)表達。但是信號肽一方面參與蛋白質(zhì)折疊成特定空間結(jié)構(gòu)，另一方面其還決定蛋白最終被定位到特定的亞細胞區(qū)，一般蛋白只有在特定亞細胞區(qū)才能發(fā)揮其功能，所以信號肽對蛋白最終活性還是有很大影響的。

E. coli

會去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸嗎？這種加工對目的蛋白的穩(wěn)定性有何影響？

N-端fMet是否被去除受倒數(shù)第二個氨基酸影響。這個加工過程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下關(guān)系支配：去除的困難程度隨倒數(shù)第二位氨基酸的支鏈大小的增加而降低。研究者在實驗中發(fā)現(xiàn)以下氨基酸種類出現(xiàn)在倒數(shù)第二的位置上時，此加工過程極少發(fā)生或根本沒有發(fā)生：His、Gln、 Glu、Phe、Met、Lys、Tyr、Trp和Arg。而當?shù)箶?shù)第二位上是其它種類的氨基酸時，加工過程發(fā)生的可能從16%到97%，確定了在大腸桿菌中蛋白氨基末端氨基酸與其穩(wěn)定性之間的關(guān)系，也即“N-端原則”。具他們報導(dǎo)：如果下列氨基酸位于氨基端時蛋白的半衰期僅為2分鐘：Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端時可以使受檢蛋白的半衰期長達10小時以上。綜上兩條研究可以得出結(jié)論：Leu在氨基末端時很容易因為fMet被去除而暴露出來，從而導(dǎo)致蛋白的迅速水解。顯然，當采用pET載體上的 Nco I 或 Nde I位點表達非融合蛋白時，完全不必擔心Leu的密碼子出現(xiàn)在倒數(shù)第二的位置上。 德泰生物原核蛋白表達服務(wù)（http://www.detaibio.com/protein-bacterial.html）采用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行重組蛋白生產(chǎn)，擁有超十年的蛋白表達經(jīng)驗，已成功交付3000+組蛋白?？蛻糁恍杼峁┠繕说鞍讓?yīng)的基因或蛋白序列，同時提供相關(guān)要求即可。我們會按照合同約定的表達量、純度進行交付。