蛋白質(zhì)互作組學，也就是研究

蛋白質(zhì)/小分子-蛋白質(zhì)之間

的相互作用，是當今生物科研領(lǐng)域的熱門話題。你知道嗎？其實在這個領(lǐng)域中，也有許多“獨門秘籍”哦！今天，讓我們一起來看看這些方法到底哪家強！

蛋白質(zhì)/小分子-蛋白質(zhì)相互作用舉足輕重

細胞功能受到蛋白質(zhì)、核酸及其相互作用的嚴格調(diào)節(jié)，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein–protein interactions，PPIs）、蛋白質(zhì)-RNA相互作用和蛋白質(zhì)-DNA相互作用。

分子相互作用網(wǎng)絡(luò)是大多數(shù)生物過程的核心

，它們的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥、免疫紊亂和神經(jīng)退行性變，因此闡明蛋白質(zhì)的分子作用機制及各種復雜的生命現(xiàn)象具有重要意義。

大規(guī)?；プ餮芯浚簭奈⒂^到宏觀的全面解析

蛋白質(zhì)作為生命活動的執(zhí)行者，其功能往往體現(xiàn)在與其他蛋白質(zhì)的相互作用中，研究

蛋白質(zhì)/小分子-蛋白質(zhì)相互作用

對于人們深入了解和預防傳染病、靶向治療多基因疾病具有重要作用。大規(guī)?；プ餮芯客ㄟ^分析個體蛋白質(zhì)組、表型特征以及環(huán)境因素之間的相互作用，揭示了個體差異和表型多樣性的復雜性并為治療干預提供見解。這種多樣性在生物進化、人類健康以及疾病發(fā)生發(fā)展等方面扮演著重要角色。 研究者們開發(fā)了許多方法進行蛋白/小分子-蛋白的相互作用研究，包括

經(jīng)典的蛋白互作研究方法和基于質(zhì)譜的蛋白互作研究方法

。經(jīng)典方法主要包括生物物理學的熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)、生物化學的免疫共沉淀和遺傳學的酵母雙雜交等。經(jīng)典研究法的

低通量、高噪音以及PPI實驗的高成本

難題亟待解決，因此高通量研究法需求應(yīng)運而生。質(zhì)譜儀具有高靈敏度、可高通量檢測等優(yōu)勢，對蛋白質(zhì)互作組學的研究能夠彌補經(jīng)典法的不足。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法盤點

基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學已經(jīng)從對生物物種中的蛋白質(zhì)進行表征發(fā)展到在多個層面上評估蛋白質(zhì)特性及其功能調(diào)節(jié)。

通過工作流程各方面的最新進展（速度、靈敏度、精確性和穩(wěn)健性），目前已經(jīng)達到了可以在幾個小時內(nèi)對幾乎完整的蛋白質(zhì)組進行簡化分析的水平。在這些技術(shù)發(fā)展的推動下，蛋白質(zhì)互作組學得到了飛快發(fā)展——

不僅可以表征互作蛋白質(zhì)組，也可以詢問生物活性分子的參與和反應(yīng)性，解決蛋白質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)中的時空動力學，并在蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)產(chǎn)生翻譯后修飾（PTM）的全面功能注釋。

小編整理了基于蛋白質(zhì)組學進行PPI研究的方法，主要包括

親和純化質(zhì)譜、共分餾質(zhì)譜、臨近標記、交聯(lián)質(zhì)譜和根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行互作蛋白篩選

[1]

。接下來將針對每個技術(shù)的原理及優(yōu)缺點進行詳細介紹，具體如下圖：

圖1?基于質(zhì)譜的蛋白/小分子-蛋白相互作用研究方法匯總

親和純化質(zhì)譜（Affinity purification–mass spectrometry，AP-MS）

在AP-MS中，用特定抗體或其他親和試劑及其潛在的相互作用伴侶（獵物）從細胞或組織裂解物中選擇性純化誘餌蛋白。該步驟之后通過MS鑒定和定量這些純化的蛋白質(zhì)，然后用不同的誘餌重復AP-MS實驗。然后統(tǒng)計計算來自這些AP-MS實驗的誘餌-獵物對的組合以推斷蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。

圖2?AP-MS技術(shù)流程

共分餾質(zhì)譜 （Co-Fractionation coupled to?mass spectrometry,?coFrac-MS）

共分餾質(zhì)譜是一種經(jīng)典的蛋白相互作用研究方法。生物分子的時空共行為，如共表達或共定位，已被提出暗示功能或物理相互作用。細胞裂解物中的蛋白質(zhì)復合物在非變性條件下通過色譜或電泳技術(shù)進行廣泛分級。然后對每個組分進行蛋白水解，用LC–MS/MS進行分析，然后通過鑒定和量化其蛋白質(zhì)組組成進行分析。隨后，可以構(gòu)建單個蛋白質(zhì)復合物亞基的分級體系。由于完整復合物的亞基傾向于共分餾，因此可以根據(jù)這些數(shù)據(jù)對蛋白質(zhì)復合物進行生物信息學預測，將分餾產(chǎn)物之間的相關(guān)性作為核心重要特征。

圖3??coFrac-MS技術(shù)流程

臨近標記（Proximity labeling ，PL）

PL是近年來發(fā)展并完善的一種鑒定蛋白相互作用的新方法。這種方法也被稱為PDB-MS（Proximity-dependent biotinylation coupled MS）或BioID（Proximity- dependent Biotin Identification）。這個方法涉及表達與生物素連接酶（BioID）、辣根過氧化物酶（HRP）或過氧化物酶（APEX）基因融合的誘餌蛋白。融合酶能夠?qū)⑼獠刻砑拥纳锼鼗蚍宇惿锼卮呋煞磻?yīng)性生物素中間體，從而與誘餌附近的生物素化蛋白質(zhì)不同。生物素標記后，裂解細胞，并使用鏈霉親和素或中性鏈霉親和素磁珠進行下拉，然后用MS進行鑒定和定量。

圖4?PL技術(shù)流程

交聯(lián)質(zhì)譜（cross-linking mass spectrometry, XL-MS）

XL-MS是將蛋白質(zhì)化學交聯(lián)技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)相互作用的新方法。在XL-MS中，選定的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物在其天然狀態(tài)下首先與能夠共價連接空間上接近的氨基酸殘基的試劑進行化學交聯(lián)。然后對交聯(lián)的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)水解，分離得到的肽混合物，并用LC-MS/MS進行分析。隨后對MS數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫搜索闡明了交聯(lián)肽的序列以及交聯(lián)位點。

圖5?XL-MS技術(shù)流程

基于蛋白的理化性質(zhì)變化進行篩選

根據(jù)蛋白的理化性質(zhì)變化進行篩選是一種相對較新的非常規(guī)方法，其

無需對原始分子進行結(jié)構(gòu)修飾

而用于蛋白質(zhì)復合物動力學的研究。主要是通過跟蹤靶蛋白的水解可及性、化學或熱穩(wěn)定性和溶解度的變化來監(jiān)測蛋白的相互作用

[2]

。這些方法主要分為四類，包括：

化學變性依賴性方法

-蛋白質(zhì)的氧化率穩(wěn)定性（Stability of proteins from rates of oxidation，SPROX）和脈沖蛋白水解（Pulse proteolysis , PP）；

熱變性依賴性方法

-細胞熱位移分析（ellular Thermal Shift Assay , CETSA）和熱蛋白質(zhì)組分析（Thermal Proteome Profiling，TPP）；

蛋白水解抗性依賴性方法

-藥物親和響應(yīng)靶標穩(wěn)定性（Drug affinity responsive target stability, DARTS）和限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)(Limited proteolysis mass spectrometry, LiP-MS)以及

溶解度依賴性方法

（Solubility-Dependent Methods, SIP）。

圖6?基于蛋白的理化性質(zhì)進行篩選的技術(shù)流程

盡管上述技術(shù)的共同目的是定性地分離蛋白質(zhì)復合物的確切組成，從這些實驗中獲得的額外信息可能會進一步闡明已鑒定PPI的結(jié)構(gòu)和功能特性，但是具體如何選擇呢？小編整理了各個技術(shù)的優(yōu)缺點，讓我們一起來看一下吧！

表1??基于MS的PPI識別和量化方法的優(yōu)缺點

上述各個技術(shù)的優(yōu)缺點提示我們在實際的應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)不同方法的特性，結(jié)合實際的研究需求，制定更加科學和高效的方案，同時也可以采取相互驗證的策略。

青蓮百奧解決方案

蛋白質(zhì)相互作用研究為我們揭示了生命活動的基本規(guī)律，并為疾病治療提供了新的途徑。隨著科學技術(shù)的不斷進步，蛋白質(zhì)相互作用研究將取得更多突破性成果，為人類健康事業(yè)帶來更多福祉。跟蹤蛋白性質(zhì)變化進行挑選是一種新穎的非傳統(tǒng)方式 ，用于研究蛋白質(zhì)復合物相互作用 。青蓮百奧提供無需進行化學修飾、適用于細胞裂物、活細胞、組織、細菌和真菌中進行蛋白/小分子-蛋白相互作用高通量篩選的限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)和熱蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)，歡迎大家前來咨詢~

參考文獻 [1] Low T Y, Syafruddin S E, Mohtar M A, et al.?Recent progress in mass spectrometry-based strategies for elucidating protein–protein interactions [J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2021, 78(13): 5325-5339. [2] Feng F, Zhang W, Chai Y, et al.?Label-free target protein characterization for small molecule drugs: recent advances in methods and applications [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2023, 223.