問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物

現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無

原因：1、模板:含有抑制物，含量低

對(duì)策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量

原因：2、Buffer對(duì)樣品不合適

對(duì)策：更換Buffer或調(diào)整濃度

原因：3、引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解

對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物

原因：4、反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短

對(duì)策：降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間

問題2：非特異性擴(kuò)張

現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶

原因：1、引物特異性差

對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR

原因：2、模板或引物濃度過高

對(duì)策：適當(dāng)降低模板或引物濃度

原因：3、酶量過多

對(duì)策：適當(dāng)減少酶量

原因：4、Mg2+濃度偏高

對(duì)策：降低鎂離子濃度

原因：5、退火溫度偏低

對(duì)策：適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法

原因：6、循環(huán)次數(shù)過多

對(duì)策：減少循環(huán)次數(shù)

問題3：拖尾

現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)

原因：1、模板不純

對(duì)策：純化模板

原因：2、Buffer不合適

對(duì)策：更換Buffer

原因：3、退火溫度偏低

對(duì)策：適當(dāng)提高退火溫度

原因：4、酶量過多

對(duì)策：適量用酶

原因：5、dNTP、Mg 2+濃度偏高

對(duì)策：適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度

原因：6、循環(huán)次數(shù)過多

對(duì)策：減少循環(huán)次數(shù)

問題4：假陽性

現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物

原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

對(duì)策：1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外

? ? ? ? ? 2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用
? ? ? ? ? 3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。

原因：引物設(shè)計(jì)不合適

對(duì)策：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性，需重新設(shè)計(jì)引物。