2022燕窩展|上海燕博會|12月滋補品展談燕窩多肽的抗氧化活性研究及理化性質分析

自由基是細胞的正常代謝產物。正常情況下，自由基的產生和清除處于平衡狀態(tài)。當自由基產生過多或機體的氧化還原系統(tǒng)失衡時，大量的自由基會損傷細胞的核酸、蛋白質以及脂質等結構，誘導細胞自噬，引發(fā)細胞凋亡，嚴重時甚至會引起各種年齡依賴性疾病，包括癌癥、心血管疾病、關節(jié)炎和阿爾茲海默癥等。因此尋找能夠有效清除自由基的天然抗氧化藥物成為了研究熱點。蔣林團隊通過三種自由基清除實驗進一步評估了燕窩多肽的抗氧化活性，并利用MALDI-TOF-MS、紫外光譜、紅外光譜等對燕窩多肽的理化性質進行研究，分析其產生抗氧化活性的成因，旨在為燕碎（粉）資源的高值化利用提供科學依據。

被譽為世界滋補行業(yè)盛會的世界燕窩及天然滋補品展覽會簡稱上海燕博會許洋，張娟一八六零一六八一八五八定于2022年12月1-3日在上海新國際博覽中心隆重召開，將有超過+500家品牌企業(yè)參展，橫跨涉及干燕窩、鮮燉燕窩、即食燕窩、凍干燕窩、燕窩粥、燕窩月餅、燕窩粽子、燕窩飲品等衍生品、即食魚膠等花膠產品、燕窩化妝品、酵素、蟲草、海參、魚膠、枸杞、陳皮、阿膠、參茸、海馬、羊肚菌、益生菌、花膠雞、佛跳墻、魚翅、西洋參、藏紅花、蜂蜜、雪蛤油、藥食同源、營養(yǎng)健康食品、滋補飲品、源頭工廠、供應原材料、相關設備、生產商以及印刷、包裝、銷售、培訓、互聯(lián)網等多個領域，既覆蓋了營養(yǎng)健康圈產業(yè)鏈上的各生產環(huán)節(jié)，也交叉跨界到與消費有關的其他領域。

1、燕窩多肽與酶解

燕窩多肽（PFC）通過酶解工藝優(yōu)化后獲得，F(xiàn)C系未被酶解的燕窩。

Jie Cao, Ning Xiong, Yu Zhang, Yuwei Dai, Yuye Wang, Lingyu Lu and Lin Jiang*. Using RSM for optimum of optimum production of peptides from edible bird's nest by-product and characterization of its antioxidant's properties[J]. Foods, 2022, 11: 859-877

2、燕窩多肽（PFC）的體外抗氧化活性

（1）DPPH自由基清除活性

不同濃度的Vc和PFC對DPPH自由基的清除活性結果如圖3-1（a）所示。PFC在0 ~ 5 mg/mL濃度下對DPPH自由基有明顯的清除作用，且呈濃度依賴性，其IC50為2.51 mg/mL。當濃度為5 mg/mL時，PFC的DPPH自由基的清除率最高，為86.44%。

（2）ABTS自由基清除活性

不同濃度的Vc和PFC對ABTS自由基的清除活性結果如圖3-1（b）所示。由圖3-1（b）可知，在0 ~ 5mg/mL的范圍內，PFC清除率隨濃度的增加而增加，IC50為2.21 mg/mL。當濃度為5 mg/mL時，PFC清除率達到最大，為70.16%。

（3）O2-自由基清除活性

PFC與Vc對O2-自由基的清除能力如圖3-1（c）所示，PFC在0 ~ 3 mg/mL范圍內對O2-自由基的清除能力隨PFC的增加而增強，當濃度大于3 mg/mL時，PFC對O2-自由基清除能力趨于平緩。但PFC的O2-自由基IC50比DPPH、ABTS自由基低，為1.67 mg/mL。在5 mg/mL時，PFC的O2-自由基清除率最大為58.44%，這說明PFC清除O2-自由基的能力較弱。

2、燕窩多肽（PFC）的分子量分布

根據不同蛋白水解產物的多肽分子量分布（聚丙烯酰胺凝膠電泳法）可知，中性蛋白酶酶解產物的分子量小于14.4 kDa。因此，為進一步確定PFC的分子量分布，采用MALDI-TOF-MS測定PFC的分子量。如圖3-2所示，PFC的分子量主要分布在3 kDa以下，且在1 kDa分子量附近的吸收強度較大。這表明PFC中主要存在的是＜3 kDa的多肽。

3、紫外光譜分析

如圖3-3所示，由于酰胺鍵和苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸的存在使得燕窩多肽（PFC）和未被酶解的燕碎（FC）在225 nm和PFC 280 nm中產生紫外吸收峰。根據朗伯比爾定律，濃度越大，吸光度越大，PEC的吸光度大于FC，說明PFC中的多肽含量更高，酶解破壞了蛋白質的結構，促進了生物活性肽的釋放。

4、紅外光譜分析

如圖3-4所示，PFC和FC在3300 ~ 3400 cm-1處有一個寬峰，屬于酰胺A帶（3000 ~ 3500 cm-1），由N-H和O-H伸縮振動引起的，通常會形成氫鍵，穩(wěn)定蛋白和多肽的二級結構。2960 cm-1的吸收峰是由C-H非對稱伸縮振動引起的，屬于酰胺B帶。酰胺 Ⅰ帶可用于預測蛋白質的二級結構，其波長范圍在1600 ~ 1670 cm-1之間，由C-O雙鍵間的伸縮振動引起。多肽通常在1600 ~ 1640 cm-1的吸收峰為β-折疊，在1650 ~ 1660 cm-1為α-螺旋結構。PFC和FC的吸收峰分別為1640 cm-1和1650 cm-1，表明FC的結構為為α-螺旋，PFC為α-折疊結構。二者蛋白結構不一致可能是因為酶解破壞蛋白質的結構，使得吸收峰紅移。由于蛋白酶的作用將大分子蛋白質變?yōu)槎嚯?，導致PFC在1550 cm-1處沒有酰胺 Ⅱ 帶的特征吸收。此外，酶解后 -COOH含量的增多使PFC在1410 cm-1處的羰基伸縮振動峰性變尖。最后，兩者都在1070 cm-1左右有一個酰胺 Ⅲ 帶。綜上所述，PFC和FC的紅外光譜圖基本一致，說明酶解在一定程度上會改變峰的位置強度和面積，但是不會出現(xiàn)新的官能團。這與酶解作用使蛋白質的二級結構發(fā)生一定變化，改變蛋白質構象比例的結論相一致。

5、X-射線粉末衍射分析

X-射線粉末衍射的吸收越強，則結晶性越強，反之則越弱。從圖3-5中可以看出，F(xiàn)C在2θ為20°時存在較寬衍射峰，結晶度較低，為無定形結構。PFC在2θ為10°、31.8°和45.37°處有較大的吸收峰，10°左右的衍射峰較寬，31.8°和45.37°的衍射峰較窄，說明PFC中存在較強結晶。這可能是因為酶解過程中，大分子蛋白質發(fā)生了重排和聚集，疏水性氨基酸生成的增多形成了結構更加穩(wěn)定的小分子肽晶體。

6、掃描電鏡分析

PFC和FC的表面形態(tài)結果如圖3-6所示。PFC和FC的微觀結構存在一定差異。FC表面完整度較高，且較為平整，呈致密的片狀結構。PFC表面的平整度下降，斷裂成小碎片。相比較FC，PFC的表面凹凸不平，疏松多孔。這可能是因為酶解作用破壞了蛋白質分子間的氫鍵和范德華力，導致蛋白粒徑減小，分子間交聯(lián)作用減弱，出現(xiàn)疏松多孔的小片狀結構。

7、總結

通過DPPH、ABTS以及O2-自由基清除實驗初步評估燕窩多肽（PFC）的抗氧化活性。結果發(fā)現(xiàn)，三種自由基清除活性隨PFC濃度的增加而增加，但它們的清除活性仍低于相同濃度的Vc。PFC清除DPPH自由基的IC50值為2.51 mg/mL，遠低于從泥鰍蛋白水解物中分離出的單體肽PSYV的IC50（17.0 mg/mL）。PFC清除ABTS自由基的IC50值為2.21 mg/mL，與盛周煌等報道的羅非魚皮膠原蛋白多肽的IC50接近。另外，其O2-自由基的IC50值為1.67 mg/mL，遠優(yōu)于從魚鰾中分離得到的單體肽YLPYA的IC50（3.61 mg/mL）。姜惠敏等認為天然活性物質的IC50值低于10 mg/mL具有良好的抗氧化活性。由此可見，PFC具有較強的抗氧化活性。

利用MALDI-TOF-MS、紫外光譜和紅外光譜等方法對PFC的理化性質進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，PFC的分子量主要集中在3 kDa以下。研究表明，分子量較小的多肽比分子量大的多肽更容易與自由基結合，自由基清除能力更強。因此，富含小分子量的多肽可能是PFC具有良好抗氧化活性的原因之一。PFC在200 ~ 220 nm和280 nm均存在紫外吸收，表明了其存在酰胺鍵和芳香性氨基酸，其中芳香性氨基酸的存在有助于增強抗氧化活性。PFC的FT-IR圖譜表明該多肽保留了源蛋白的官能團結構，酶解產物PFC中β-折疊結構較多，可提高PFC的自由基清除能力。X-射線粉末衍射和掃描電鏡的結果都說明了酶解會破壞蛋白質的結構，在降解過程中可能導致更多疏水性基團的暴露，進而增強PFC的抗氧化活性。綜上所述，小分子量的低聚肽、疏水性氨基酸和特殊的微觀形貌和空間結構賦予PFC良好的抗氧化活性。本實驗的結果為進一步研究燕窩的藥理作用奠定了基礎。

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