基因與藥物共傳遞的應(yīng)用有助于解決RNA藥物作用時間短的問題

RNAi是控制靶標基因表達的有力工具，但是，作為RNAi觸發(fā)器的小干擾RNA (small interfering RNAs)或者短發(fā)夾（RNA short hairpin RNAs），往往容易誘發(fā)機體不利的副作用，從而影響其治療效果。2022年4月，Becker等人以評論的形式在Molecular Therapy Nucleic Acids雜志上發(fā)表文章。Alsing及其同事通過將依賴于Argonaute 2的shRNA（agshRNAs）嵌入到micro RNA主鏈中，從而實現(xiàn)RNA polymerase II啟動子的組織特異性表達。此外，通過RNA-seq對agshRNAs和傳統(tǒng)shRNA產(chǎn)生的副作用進行深入的比較。這項研究證實了提高RNAi安全性和效率，以及檢測方法監(jiān)測序列特異性或非特異性副作用的潛力。此外，該研究還強調(diào)，同時確保靶標基因敲除效率與治療效果不是特別容易實現(xiàn)的。

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通過外源引入或人工表達RNAi?觸發(fā)器，利用內(nèi)源性RNAi途徑進行靶向?mRNA沉默已有20多年的研究歷史。其中，最常用的RNAi觸發(fā)器是shRNA，尤其是通過慢病毒或腺相關(guān)病毒載體遞送時，可以實現(xiàn)持續(xù)性的目標敲除。它們的表達通常由諸如U6之類的RNA pol III啟動子驅(qū)動，它可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中產(chǎn)生大量的RNAi效應(yīng)子，并產(chǎn)生強有力的基因敲低。然而，根據(jù)shRNA序列、豐度和其他參數(shù)，shRNA可能誘導(dǎo)不良副作用，包括（1）脫靶效應(yīng)；（2）細胞RNAi機制的飽和以及與內(nèi)源性miRNA的競爭；（3）誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在最壞的情況下能夠?qū)е麦w內(nèi)毒性。

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以往對于哺乳動物細胞內(nèi)miRNAs的處理過程的認識和了解，極大的促進了我們對RNAi觸發(fā)器的認識。通常情況下，在primary miRNAs表達之后，這些分子經(jīng)歷了兩步成熟過程。首先，Drosha/DGCR8復(fù)合物在發(fā)夾莖的5’和3’端修剪primary miRNAs，產(chǎn)生一個precursor miRNA的中間物；接下來，Exportin-5?將precursor miRNA（或?shRNA）轉(zhuǎn)位到細胞質(zhì)中，在由?RNase III Dicer?進一步加工。產(chǎn)生的?RNA?雙鏈體與?RNA?誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物?RISC?中的四種?Argonaute?蛋白?(Ago1-4)?之一結(jié)合，其中引導(dǎo)RNA鏈保持與目標mRNA的結(jié)合，隨從鏈則被降解。在shRNAs的情況下，一個令人擔憂的問題是，隨從鏈偶爾會被保留下來，然后誘發(fā)對非目標mRNAs的不必要的抑制。

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如前所述，這一點可以通過利用基于miRNA miR451的改良的僅有導(dǎo)引的效應(yīng)器而得到緩解。這種miRNA使用一種非經(jīng)典的、與Dicer無關(guān)的途徑，在細胞質(zhì)中由Ago2通過裂解第10/11位的3’-發(fā)夾莖直接處理，然后由Poly（A）特異性核糖核酸酶（PARN）修剪。MiR451類似物被發(fā)現(xiàn)是獨立于Ago1、Ago3或Ago4的，這減少了它們對內(nèi)源miRNA的競爭和脫靶的可能性，從而提高了其安全性。例如，Ago2-sliced agshRNAs，使用一個引導(dǎo)序列，形成一個17-18bp的莖和一個4nt的環(huán)。

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在他們目前的研究中，Alsing及其同事生成并直接比較了Vegfa靶向shRNAs以及基于miR451或miR324的相應(yīng)的agshRNAs。正如所希望的那樣，在培養(yǎng)的細胞中，agshRNAs顯示出（1）對反義靶點沒有可檢測的客體鏈活性，（2）與內(nèi)源性miRNAs的競爭減少，以及（3）與shRNA對應(yīng)物相比，LV轉(zhuǎn)導(dǎo)后的毒性部分減少。競爭和毒性都受特定靶標序列的影響，而不是受RNAi效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的影響。有趣的是，通過將agshRNAs嵌入miRNA骨架（miR-agshRNAs），將agshRNAs的表達從U6切換到RNA pol II啟動子時，這兩種副作用都被取消了。然而，這是以降低敲除效率為代價的。為了證明miR-agshRNAs在體內(nèi)的適用性，Alsing等人選擇了他們以前用于基于miRNA的Vegfa敲除的RPE特異性VMD2啟動子。然而，整體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率太低，在沒有事先對轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞進行熒光激活細胞分選的情況下，無法檢測出效應(yīng)物誘導(dǎo)的基因敲除。

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為了進一步研究對細胞轉(zhuǎn)錄組的影響，Alsing等人用含有U6啟動子驅(qū)動的表達盒的LV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)ARPE19細胞，用于三個相應(yīng)的shRNA/agshRNA對。使用RNAseq結(jié)合不同調(diào)控基因的聚類，通過基因本體的富集和七聚體種子匹配分析，這使得不同效應(yīng)物引起的幾個副作用得到了確認。這些結(jié)果進一步說明了agshRNAs的優(yōu)點，如減少由客體鏈種子介導(dǎo)的脫靶敲除，它們還揭示了序列特異性的脫靶效應(yīng)，這些效應(yīng)在具有共同引導(dǎo)鏈的sh-和agshRNAs之間共享。

總的來說，這項工作完美地說明了RNAi領(lǐng)域不斷取得的顯著進展，并最終將有助于縮小其臨床轉(zhuǎn)化的差距。從（1）經(jīng)典的U6啟動子驅(qū)動的shRNAs及其體內(nèi)毒性傾向，到（2）乘客鏈活性降低和內(nèi)源性miRNA競爭的amshRNAs，這里報告的（3）由組織特異性RNA pol II啟動子驅(qū)動的miRNA嵌入的新類別有望在RNAi特異性和安全性方面實現(xiàn)又一次飛躍（圖1）。然而，許多觀察到的副作用被發(fā)現(xiàn)取決于引導(dǎo)鏈的序列，因此，未來的迭代完全可以比較多個不同的效應(yīng)物序列，以確定結(jié)合強大的目標擊倒和最小副作用的候選物，并闡明基本的設(shè)計規(guī)則。值得注意的是，目前作者已經(jīng)成功地證明了轉(zhuǎn)錄組分析對于分層的價值，可以全面地了解特定RNAi效應(yīng)物所引起的副作用。在未來，將非效應(yīng)物對照作為RNA pol II或pol III驅(qū)動的RNAi系統(tǒng)引起的固有轉(zhuǎn)錄組變化的參考，將是有趣和有意義的。最后，正如VMD2啟動子驅(qū)動的miR-agshRNAs通過LV載體在體內(nèi)的應(yīng)用所證明的那樣，實現(xiàn)治療性敲除需要高效的載體以及強大的RNAi效應(yīng)物和強大的表達系統(tǒng)。很明顯，這些組件中的每一個都需要進行關(guān)鍵的剖析、平衡和微調(diào)，以使足夠的敲除效率與最大的安全性并存。為此，本研究的優(yōu)點之一是我們現(xiàn)在有了一個擴大的工具集，可用于研究、比較和優(yōu)化體外和體內(nèi)的所有這些參數(shù)，這將最終有助于加速臨床RNAi的轉(zhuǎn)化。

原文鏈接（文中圖片均來源于該論文）：

https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.03.027