神經(jīng)退行性疾病是一種神經(jīng)系統(tǒng)慢性進(jìn)行性損害疾病，以遠(yuǎn)端軸突損傷和逆死性神經(jīng)病變?yōu)橹饕卣?，然而從軸突損傷到神經(jīng)元死亡的途徑仍不完全清楚?；虮磉_(dá)的變化是神經(jīng)損傷的重要表現(xiàn)，在體內(nèi)高通量篩選轉(zhuǎn)錄因子，以確定神經(jīng)元損傷或軸突再生的關(guān)鍵調(diào)控因子是研究神經(jīng)退行性疾病的有效方案，CRISPR-gRNA文庫篩選結(jié)合多組學(xué)分析為實現(xiàn)體內(nèi)大規(guī)模遺傳篩選提供了雙重保障。

文章標(biāo)題：Core transcription programs controlling injury-induced neurodegeneration of retinal ganglion cells.

發(fā)表期刊：Neuron（IF=18.688）

合作客戶：哈佛醫(yī)學(xué)院

維真助力：小鼠gRNA AAV載體庫

· 維真生物 ·
小鼠gRNA AAV載體庫

種屬：小鼠

數(shù)量：近13000

載體：AAV

應(yīng)用：可以直接用于AAV包裝，可與spCas9 AAV病毒或者spCas9轉(zhuǎn)基因動物搭配使用，輕松實現(xiàn)目的基因的體內(nèi)基因敲除，方便目的基因的功能研究。

優(yōu)勢：?1、載體GFP熒光標(biāo)簽，便于監(jiān)測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；2、可以直接進(jìn)行AAV包裝；3、與單條gRNA相比，每個目的基因4-5條gRNA pool的設(shè)計，極大增加敲除效率；4、可提供整個小鼠gRNA pool 克隆庫，也可提供各類子庫，如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、磷酸酶、藥物靶點、膜蛋白等。5、全部現(xiàn)貨，大大縮短科研周期。

文章摘要

多數(shù)神經(jīng)退行性疾病表現(xiàn)為相同的病理特征，其中極具破壞性的是神經(jīng)元死亡，但目前神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元死亡和軸突再生的調(diào)控程序仍知之甚少。為了確定成年個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷導(dǎo)致神經(jīng)退行性變的機(jī)制，研究人員利用了視神經(jīng)擠壓(ONC)模型，即通過切斷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)軸突導(dǎo)致ONC，進(jìn)而導(dǎo)致大量RGC死亡和再生失敗?；贑RISPR-gRNA文庫篩選技術(shù)，研究人員對1893個轉(zhuǎn)錄因子(TF)進(jìn)行全基因組篩選，尋找ONC后RGC存活和軸突再生的抑制因子，同時通過ATAC-seq和RNA-seq等分析損傷RGC的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄情況，確定了損傷響應(yīng)性TF及其靶標(biāo)。研究結(jié)果揭示了從軸突損傷轉(zhuǎn)化為神經(jīng)退行性疾病的核心轉(zhuǎn)錄程序，并提出了治療神經(jīng)退行性疾病的新策略。

部分結(jié)果展示

1. CRISPR-gRNA文庫篩選技術(shù)結(jié)合表觀遺傳分析篩選神經(jīng)元存活和軸突再生的負(fù)調(diào)控TF

作者利用RIKEN和TFCat數(shù)據(jù)庫匯總了1893個小鼠基因組中的TF，并針對每個TF基因不同區(qū)域，從CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫中選擇了五條sgRNAs，然后pool在一起克隆至AAV2載體，建立了一個包含1893個AAV2-sgRNA的文庫（維真生物助力提供）。隨后借助AAV2將sgRNAs和Cas9引入RGC，ONC后兩周進(jìn)行篩選檢測以確定調(diào)控神經(jīng)元存活和軸突再生的TF。實驗結(jié)果確定了10個負(fù)調(diào)控神經(jīng)元存活的TF和13個負(fù)調(diào)控軸突再生的TF。通過整合ATAC-seq，RNA-seq，TF footprinting信息篩選到4種負(fù)調(diào)控RGCs損傷存活的關(guān)鍵TF：ATF3、ATF4、C/EBPγ和CHOP。之后作者重點探究了這四個關(guān)鍵的TF調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序，發(fā)現(xiàn)ATF3/CHOP優(yōu)先調(diào)節(jié)由細(xì)胞因子和先天免疫激活的通路，ATF4/C/EBPγ調(diào)節(jié)由內(nèi)在神經(jīng)元應(yīng)激源激活的通路。

2. 受損RGC中的關(guān)鍵TF存在功能性交互作用

ATF3/CHOP和C/EBPγ/ATF4作為ONC后RGC存活和軸突再生的兩組負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，作者推測與單個TF敲除相比，聯(lián)合操縱來自兩組的TF可能具有疊加效應(yīng)，并進(jìn)一步提高RGC的存活率。作者發(fā)現(xiàn)：TF的單個敲除相較于對照組顯著提高了RGC的存活率；與敲除單個TF相比，TF的交替組合敲除(ATF3/C/EBPγ, ATF3/ATF4和C/EBPγ/CHOP)顯著提高RGC存活率；但同組內(nèi)共敲除TF（ATF3/CHOP 或 ATF4/C/EBPg）的保護(hù)作用并不明顯。這表明ATF3/CHOP和ATF4/C/EBPγ在神經(jīng)元損傷后激活兩條平行的促死亡通路，兩通路間存在重疊和互補(bǔ)作用。

實驗結(jié)論

本研究通過獨立的體內(nèi)遺傳篩選和損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的多組學(xué)分析，確定了四種損傷后神經(jīng)元存活的關(guān)鍵互補(bǔ)調(diào)控因子（ATF3、CHOP、ATF4、C/EBPγ），這些基因分別調(diào)節(jié)兩種不同的退行性程序，以應(yīng)對外在和內(nèi)在的壓力。