報告基因（reporter gene）是指一類所編碼蛋白易于檢測（如發(fā)光、染色、抗性等）的基因，且這些基因產(chǎn)生的性狀不存在于原本的受體細(xì)胞/組織器官/個體中。常用的報告基因包括熒光蛋白（EGFP、mCherry等）、熒光素酶（Luciferase，如Fluc、Rluc等）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。

其中LacZ可以被X-gal染色變藍(lán)，常用于整體胚胎或組織切片的基因表達(dá)研究，較少用于細(xì)胞實驗。熒光素酶需要加入熒光素底物后才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，熒光蛋白則在特定波長的激發(fā)光照射下可以自發(fā)熒光，這兩類報告基因常用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗、基因表達(dá)檢測、啟動子/增強(qiáng)子研究、活體成像、蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞示蹤等。今天小源給大家介紹這兩類報告基因在細(xì)胞水平常見的應(yīng)用以及選擇策略，希望能為大家的實驗設(shè)計提供一些思路。

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利用Luc/EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，建立可實時觀察的小鼠移植瘤模型。

構(gòu)建能表達(dá)熒光素酶或熒光蛋白的細(xì)胞系，并將其移植至動物體內(nèi)，通過分子成像技術(shù)或閃爍計數(shù)器可進(jìn)行定量、定性及體內(nèi)跟蹤研究，常用于癌癥、腫瘤細(xì)胞移植研究。翟向明等人[1]通過構(gòu)建含有熒光素酶和熒光蛋白的慢病毒載體PTYF-CMV-Luc-2A-RFP-PGK，再通過慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝后感染肝癌細(xì)胞SMMC7721，以嘌呤霉素（Puro）進(jìn)行篩選，結(jié)合有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞株，再將Luc-2A-RFP細(xì)胞原位注射到裸鼠肝組織，建立原位肝癌動物模型。經(jīng)活體熒光成像系統(tǒng)成功觀察到肝癌細(xì)胞在活體動物體內(nèi)的分布情況，為肝癌的治療研究奠定了基礎(chǔ)（圖1，圖2）。

魏淑珍等[2]用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法將EGFP基因?qū)肴朔伟┘?xì)胞系NCI-H460中，構(gòu)建能穩(wěn)定高表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞株并進(jìn)行裸鼠皮下成瘤，而后采用原位移植法建立小鼠肺癌原位移植模型，并應(yīng)用小動物活體熒光成像系統(tǒng)觀察腫瘤的生長，該模型可以用于腫瘤藥物篩選及其他相關(guān)研究（圖3，圖4）。

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通過CRISPR/Cas9原位敲入EGFP，構(gòu)建報告細(xì)胞系用于藥物篩選。

APOBEC3B（A3B）是一種DNA編輯酶，在多發(fā)性骨髓瘤和各種其他癌癥中誘導(dǎo)基因組DNA突變。為了方便研究A3B的功能，Yamazaki等[3]通過CRISPR/Cas9技術(shù)在A3B的3'端敲入了3xFlag-IRES-EGFP，構(gòu)建了3種骨髓瘤細(xì)胞（U266、RPMI8226、AMO1?）的A3B報告細(xì)胞系。通過靶向A3B基因的shRNA慢病毒進(jìn)行敲降驗證發(fā)現(xiàn)：當(dāng)A3B mRNA下調(diào)時，EGFP熒光強(qiáng)度也隨之降低，這證實了報告細(xì)胞模型的可行性，可用于后續(xù)抗癌藥物測試（圖5）。

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用Luc/EGFP檢測啟動子表達(dá)活性

???????相比于傳統(tǒng)的Western?Blot、ELISA等方法，報告基因可以在活體中更為直觀地監(jiān)測目標(biāo)基因表達(dá)水平或啟動子活性。一般采用在啟動子序列后插入熒光蛋白/熒光素酶的方式對進(jìn)行監(jiān)測。如：Nina Solberg和Stefan Krauss[4]將mTcf3啟動子片段克隆到含有Fluc?cDNA的pGL3-basic報告載體中，通過對比螢火蟲熒光素酶活性與內(nèi)參海腎熒光素酶的活性研究小鼠胚胎衍生神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）中克隆的mTcf3啟動子DNA片段的活性，并發(fā)現(xiàn)在4.5?kb和3.5?kb啟動子片段之間的截斷片段中存在抑制啟動子活性的調(diào)控元件（圖6）。

用雙熒光素酶報告系統(tǒng)研究miRNA與3'UTR的作用

???????目前研究miRNA靶基因的常規(guī)思路為：利用基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫等生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA的靶基因為研究提供思路，再通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)行驗證。雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證這一步需要在載體上將目的基因3’UTR序列連接至熒光素酶3’端上，通過比較miRNA過表達(dá)前后發(fā)光強(qiáng)度的改變來確定與miRNA作用的靶基因。如：Marcos等人?[5]經(jīng)表達(dá)數(shù)組分析將GSK3B假定為miR-548q和miR-1185-1減肥干預(yù)的靶基因，并用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)行驗證。他們在螢火蟲熒光素酶基因下游克隆了GSK3B特異的3’-UTR結(jié)合區(qū)，并構(gòu)建載體與miR-548q、miR-1185-1模擬物共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293T細(xì)胞中，驗證了GSK3B為miR-1185-1的靶基因（圖7）。

此外，報告基因在蛋白質(zhì)相互作用、RNA干擾研究、陽性克隆篩選等方面也有應(yīng)用。在上述案例中，我們發(fā)現(xiàn)，報告細(xì)胞系從表達(dá)基因上分兩種，一種熒光素酶報告基因，另一種是熒光蛋白報告基因。從構(gòu)建方法上也分為兩種，一種是過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)，另一種是原位敲入（Knockin，KI），這兩種報告基因和構(gòu)建方法有何差別，如何選擇呢？小源給大家整理了以下干貨內(nèi)容：

熒光素酶相較于熒光蛋白具有靈敏度高、背景干擾低、熒光強(qiáng)度高穿透力強(qiáng)、且容易定量的優(yōu)勢，較常用于啟動子活性檢測、miRNA功能研究，小鼠移植瘤模型構(gòu)建等。而熒光蛋白的優(yōu)勢主要為觀察方便不需要加底物、毒性低、多種顏色熒光可供選擇、圖像直觀漂亮，適用于多基因報告系統(tǒng)，常用做穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞Marker、內(nèi)源基因示蹤標(biāo)記、蛋白定位標(biāo)記及活體成像（一般需要把小動物毛發(fā)剔除降低背景干擾）?？傮w的說，在大部分情況下這兩種報告基因都可以使用，具體可以結(jié)合需求與優(yōu)缺點進(jìn)行選擇，也有很多研究者采用熒光素酶與熒光蛋白相結(jié)合共表達(dá)的方式構(gòu)建多功能報告細(xì)胞。而關(guān)于構(gòu)建方法，一般來說內(nèi)源基因示蹤和蛋白定位等需要采用原位KI的方式構(gòu)建，其他應(yīng)用采用過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株即可滿足實驗需求。

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參考資料

[1]?翟向明, et al."攜帶熒光素酶基因肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建及在肝癌原位移植瘤模型中應(yīng)用."?生物技術(shù)?28.01(2018):71-76. doi:10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.01.0013.

[2]?魏淑珍,etal."EGFP標(biāo)記的人肺癌裸鼠原位移植模型的建立."?中國肺癌雜志?13.07(2010):670-675.

[3]?Yamazaki H, Shirakawa K, Matsumoto T, et al. APOBEC3B reporter myeloma cell lines identify DNA damage response pathways leading to APOBEC3B expression[J]. PloS one, 2020, 15(1): e0223463.

[4]?Solberg N, Krauss S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 2013;977:65-78. doi: 10.1007/978-1-62703-284-1_6. PMID: 23436354.

[5]?Garcia-Lacarte M, Mansego ML, Zulet MA, Martinez JA, Milagro FI. miR-1185-1 and miR-548q Are Biomarkers of Response to Weight Loss and Regulate the Expression of GSK3B. Cells. 2019 Nov 30;8(12):1548. doi: 10.3390/cells8121548. PMID: 31801236; PMCID: PMC6953011.