海星第三代CRISPR基因敲除試劑盒

Cas9x3.0

讓基因敲除更簡(jiǎn)單、更高效！

產(chǎn)品介紹

CRISPR基因敲除試劑盒(Cas9x3.0)是海星生物在多年基因編輯服務(wù)的基礎(chǔ)上研發(fā)的高效快捷的基因敲除試劑盒。包括了人(Human)和小鼠(Mouse)的所有基因的敲除。

Cas9x3.0試劑盒包含2個(gè)Cas9X?算法優(yōu)化的gRNA序列載體和特異的同源DNA片段，DNA片段含有抗性和GFP熒光，并攜帶有一段特殊同源序列，不僅可為后續(xù)基因敲除細(xì)胞的篩選提供藥物抗性，也可以通過(guò)流式篩選獲得敲除細(xì)胞。

Cas9x3.0試劑盒對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都有非常高的敲除效率。

原理介紹

CRISPR基因敲除試劑盒 (Cas9x3.0)依據(jù)HDR和NHEJ修復(fù)原理進(jìn)行產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

優(yōu)化的gRNA引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB），并誘導(dǎo)同源線性化DNA片段（攜帶抗性基因和熒光基因）整合到該位點(diǎn)，再通過(guò)抗性藥物（puroR）或熒光（eGFP）進(jìn)行篩選，從而獲得基因敲除的細(xì)胞和單克隆。

CRISPR基因敲除試劑盒 (Cas9x3.0) 的敲除效率是傳統(tǒng)基因敲除策略的2~5倍。因?yàn)槠洫?dú)有的敲除策略是通過(guò)在基因位導(dǎo)入Donor DNA（ puroR & eGFP ）從而達(dá)到敲除目的蛋白效果，同時(shí)也可以在DSB位點(diǎn)導(dǎo)入序列移碼，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。這兩個(gè)原理的疊加，可以輕松獲得“等位基因”純合敲除細(xì)胞株。

技術(shù)原理

應(yīng)用流程

CRISPR基因敲除試劑盒 (Cas9x3.0)操作步驟(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)：

本試劑盒建議采用轉(zhuǎn)染試劑是Lipofectamine? 2000 Reagent (cat#11668-030)，具體參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明材料。不同類型的轉(zhuǎn)染試劑，請(qǐng)按照制造商的操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

注意：懸浮細(xì)胞不推薦使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。

CRISPR基因敲除試劑盒 (Cas9x3.0)操作步驟(電轉(zhuǎn)化法)：

本試劑盒推薦Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，具體參照設(shè)備對(duì)每種細(xì)胞參數(shù)。不同類型的電轉(zhuǎn)設(shè)備，請(qǐng)按照制造商的操作說(shuō)明進(jìn)行優(yōu)化。

注意：懸浮細(xì)胞推薦使用電轉(zhuǎn)化法。

CRISPR基因敲除試劑盒 (Cas9x3.0)配有eGFP對(duì)照DNA，可以按照實(shí)際使用的方法和細(xì)胞情況，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索，建議48小時(shí)后的目的細(xì)胞的eGFP的陽(yáng)性率不低于50%， Cas9x3.0試劑盒才能獲得最佳敲除效果。

產(chǎn)品應(yīng)用

PCR操作流程

細(xì)胞操作流程

單克隆和細(xì)胞檢測(cè)

細(xì)胞單克隆檢測(cè)方案：

1、極限稀釋法：按照每個(gè)孔2~3個(gè)細(xì)胞進(jìn)行稀釋，并將有增殖的克隆轉(zhuǎn)移到96孔中擴(kuò)增和PCR檢測(cè)；

2、克隆環(huán)法：按照5% 的匯合度接種細(xì)胞，讓細(xì)胞形成完整的獨(dú)立的單克隆團(tuán)，使用克隆環(huán)進(jìn)行消化和擴(kuò)增和PCR檢測(cè)；

3、流式篩選法：通過(guò)流式分選的方式，將帶有GFP熒光的細(xì)胞分選到每個(gè)孔中，并進(jìn)行擴(kuò)增和PCR檢測(cè)。

成功案例分析

• 作者：海星生物

• 公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因編輯

• 以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

• 服務(wù)內(nèi)容：CRISPR/Cas9細(xì)胞基因編輯　載體構(gòu)建/病毒包裝 PDO/動(dòng)物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 干細(xì)胞/原代細(xì)胞 培養(yǎng)試劑盒