用于真正并行多目標(biāo)成像的光譜分辨熒光壽命成像 (sFLIM)

? 結(jié)合壽命和光譜信息，明確識別多種不同的熒光標(biāo)記

? 可將多種熒光標(biāo)記與自發(fā)熒光進行有效的區(qū)分

? 支持高計數(shù)率工作，每秒可采集多張sFLIM圖像

Spectral FLIM (sFLIM) 是一種結(jié)合光譜分辨和熒光壽命信息的成像方法。由于各種技術(shù)的提升，使sFLIM成為了一種快速、通用且靈敏的檢測手段。其中一項重大的技術(shù)改進是使用 16 通道光譜熒光壽命成像探測器。該探測陣列中包含16個配備了GaAsP陰極的PMT檢測器，其探測效率高達(dá)45%。sFLIM的探測器陣列連接到具有16個獨立輸入通道的TCSPC模塊——MultiHarp 150。這些輸入通道中的每一路都具有超低的死區(qū)時間——650ps，允許在TCSPC直方圖失真最小和幾乎沒有光子計數(shù)損失的情況下，進行高計數(shù)率的sFLIM測量。

這種組合下的計數(shù)率高達(dá)65Mcps。由于熒光信號同時被記錄在多個通道中，因此有效地降低了由探測器脈沖堆積效應(yīng)導(dǎo)致的熒光衰減失真現(xiàn)象。因為MultiHarp 1502超短的死區(qū)時間，不會丟棄任何光子，將光子損失控制在最低限度。

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另外，也已開發(fā)出一種模式匹配方法，通過充分利用光譜和壽命信息，以快速可靠的方式分析sFLIM的測量結(jié)果。通過使用多個散點圖，可以一目了然地顯示不同的光譜和壽命種群。通過在散點圖中定義區(qū)域，可以推斷出參考模式，然后將其用于sFLIM圖像1的線性分解。這種模式匹配方法可作為公開訪問的MatLab分析例程使用（托管在GitHub上）。請注意，該軟件不是PicoQuant 的常規(guī)產(chǎn)品，因此PicoQuant不會為其提供任何技術(shù)支持。

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sFLIM最具應(yīng)用前景的方向就是同時測量多個熒光標(biāo)記，如熒光蛋白，F(xiàn)RET探針或環(huán)境敏感探針。也可以區(qū)分由于樣品自發(fā)熒光引起的熒光背景3。

應(yīng)用舉例

間接標(biāo)記技術(shù)對一抗和二抗對進行嚴(yán)格選擇，以避免假陽性免疫標(biāo)記。因此，間接免疫熒光通常局限于2~4種抗原，或者在最壞的情況下，目標(biāo)分子標(biāo)記的特定結(jié)合根本無法進行。

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在此應(yīng)用示例中，我們提出了一種新方法，通過光譜 FLIM-FRET 分離熒光信號來利用二抗交叉標(biāo)記的表面缺點。這之所以成為可能，是因為二抗之間不希望的交叉標(biāo)記導(dǎo)致產(chǎn)生新的特征 FRET 發(fā)射光譜，包括供體壽命的變化。為了證明這一點，我們采用了一種順序標(biāo)記方案，并在相互作用的二抗體(如Alexa488和Alexa546)上選擇了合適的熒光團對，以實現(xiàn)強FRET現(xiàn)象。

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作為模型，我們在人肺組織中標(biāo)記了目標(biāo)分子泛細(xì)胞角蛋白、TOM20 和高爾基體蛋白。一抗和二抗的結(jié)合導(dǎo)致了TOM20 的單標(biāo)記以及泛細(xì)胞角蛋白的交叉標(biāo)記。我們使用了一個八通道光譜分辨熒光壽命成像(sFLIM) 的檢測系統(tǒng)，用兩個激光波長在脈沖交替激發(fā) (PIE)模式下，激發(fā)所有的標(biāo)記，并獲取了其數(shù)據(jù)。

通過采用源自未染色樣品的三種模式來考慮來自人肺組織的強自發(fā)熒光（源自紅細(xì)胞、膠原蛋白和殘留的自發(fā)熒光 (AF)）?？紤]到發(fā)射光譜以及納秒時間分辨熒光衰減3，使用模式匹配算法1進行數(shù)據(jù)分析。

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通過該方法，僅由兩種熒光團產(chǎn)生的熒光，就使我們能夠精確區(qū)分所有三種目標(biāo)分子，這要歸功于熒光團物質(zhì)的交聯(lián)和產(chǎn)生的FRET相互作用。同時，可以分離由人肺組織的三種自發(fā)熒光產(chǎn)生的外源熒光。因此，光譜FLIM-FRET與模式匹配分析一起通過克服二抗交叉標(biāo)記的不良影響和區(qū)分不需要的組織自發(fā)熒光，形成了用于間接免疫熒光的出色工具。

文獻

1?Nieh?rster, T. et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, Nature Methods, 257-262, 13(3), 2016

2?Wahl, M. et al. Photon arrival time tagging with many channels, sub-nanosecond deadtime, very high throughput, and fiber optic remote synchronization, Review of Scientific Instruments, Vol.091, 013108. 2020

3?Rohilla. S. et al. Multi-target immunofuorescence by separation of antibody crosslabelling via spectral-FLIM-FRET, Scientific Reports, Vol.010, 3820, 2020

4?Meyer, J. et al. Rapid Fluorescence Lifetime Imaging Reveals That TRPV4 Channels Promote Dysregulation of Neuronal Na+?in Ischemia, Journal of Neuroscience, Vol. 42, Issue 4, 2022