前言

2021年11月，寧波大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院王春琳?qǐng)F(tuán)隊(duì)在Frontiers in Marine Science期刊發(fā)表了題為“Metabolic Changes in Scylla paramamosain During Adaptation to an Acute Decrease in Salinity”的研究成果，通過(guò)LC-MS非靶向代謝組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了氨基酸和能量代謝是參與青蟹適應(yīng)鹽度變化的主要因素，而脂質(zhì)代謝物起輔助作用。

基本信息

中文標(biāo)題：青蟹在適應(yīng)鹽度急劇下降過(guò)程中的代謝變化

研究對(duì)象：青蟹

發(fā)表期刊：Frontiers in Marine Science

影響因子：4.912

發(fā)表時(shí)間：2021年11月2日

合作單位：寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

運(yùn)用生物技術(shù)：LC-MS非靶向代謝組學(xué)(由鹿明生物提供技術(shù)支持)

研究背景

青蟹是一種廣鹽甲殼類(lèi)動(dòng)物，廣泛分布于從印度洋到西太平洋地區(qū)，包括中國(guó)東南沿海地區(qū)，它對(duì)鹽度的突然降低極其敏感。青蟹生活在咸水和咸水河口，成熟的雌性遷徙到近海繁殖，而這些地區(qū)容易受到大雨或水環(huán)境大規(guī)模變化的影響，導(dǎo)致鹽度急劇下降。大幅度降低鹽度可能會(huì)超過(guò)青蟹調(diào)節(jié)滲透壓的能力，從而導(dǎo)致死亡。因此，青蟹適應(yīng)急性鹽度降低的生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。

研究思路

研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組

(1) CK組: 海水鹽度為23 psu、溫度為20°C?

(2) LS組: 海水鹽度為3 psu、溫度為20°C

2.鰓中血清滲透壓和酶活性的測(cè)定：ELISA檢測(cè)

3.LC-MS非靶向代謝組學(xué)分析

研究結(jié)果

鹽度急速降低對(duì)青蟹血淋巴滲透壓的影響

鹽度從23下降到3 psu后，青蟹的血淋巴滲透壓開(kāi)始迅速下降，在6 h達(dá)到最低點(diǎn)606.50 mOsm/kg HO，然后開(kāi)始上升，在24 h達(dá)到最高點(diǎn)，在它緩慢下降并在 48 小時(shí)后穩(wěn)定之前（圖 1A）。

圖1 | 鹽度對(duì)青蟹血淋巴滲透壓的影響。

(A)顯示了鹽度變化下青蟹滲透壓的變化；

(B)是青蟹和海水的滲透壓等滲圖。在(B)中，D1和C1分別是青蟹在鹽度23和3的血淋巴滲透壓，C2和D2分別是23和3 psu的海水滲透壓。

海水鹽度為 23 psu時(shí)，海水的滲透壓 (D2) 為 601.75 mOsm/kgHO，青蟹血淋巴的滲透壓 (C2) 為726.75mOsm/kg HO(圖 2B ) ;?當(dāng)海水鹽度降至 3 psu 時(shí)，海水的滲透壓（D1）為 77.18 mOsm/kgHO，青蟹血淋巴的滲透壓為 642.38 mOsm/kgHO（圖 2B）?？梢钥闯觯?~23 psu的環(huán)境中，青蟹的滲透壓始終高于海水的滲透壓，并且青蟹的滲透壓不會(huì)隨著海水滲透壓的快速下降而大幅度降低。

圖2 | 鹽度對(duì)青蟹鰓離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性的影響

* 表示不同鹽度下離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性同時(shí)存在顯著差異。

鹽度急速降低對(duì)青蟹鰓中參與滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性的影響

對(duì)當(dāng)鹽度從23 psu降至3 psu時(shí)，Na-K-ATPase活性在6 h后升高至31.53 U/mL，該值明顯高于CK組。24 h 后活性逐漸下降，最終達(dá)到 24.28 U/mL 的平衡狀態(tài)（圖 2A）。CA 活性在前 6 小時(shí)內(nèi)增加，此后保持在此穩(wěn)定狀態(tài)。此外，LS組的CA活性（16.54 U/mL）顯著（1.8倍）高于CK組。V-ATPase 活性在前 6 小時(shí)內(nèi)增加，達(dá)到 21.88 U/mL，然后穩(wěn)定下來(lái)（圖 2）。

鹽度驟降引起青蟹鰓的代謝物變化

采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)CK和LS蟹鰓代謝組的變化。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理，共檢測(cè)到 16,261 個(gè)質(zhì)譜特征信號(hào)，鑒定出 4,023 種代謝物。鰓提取物的可檢測(cè)代謝物含有脂肪?；Ⅳ人峒捌溲苌?、甘油磷脂等。

圖3 | LC-MS非靶向代謝組學(xué)分析

在 ESI (+) (A)和 ESI (-) (B)中來(lái)自QC樣品的鰓樣品的BPC；青蟹的CK和LS的PCA得分圖(C)、OPLS-DA 得分圖(D)和響應(yīng)排列測(cè)試(E)。

研究者運(yùn)用主成分分析（PCA）、質(zhì)量控制 (QC) 等進(jìn)一步證實(shí)了數(shù)據(jù)的可靠性。PCA結(jié)果顯示CK組和LS組有比較明顯的分布規(guī)律（圖3C）。同時(shí)，OPLS-DA 模型顯示兩組之間的差異顯著（x 軸方向），所有樣本點(diǎn)均在 95% 置信區(qū)間內(nèi)（圖 3D）。通過(guò)對(duì)OPLS-DA模型的擬合檢驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)模型對(duì)樣本的解釋能力[R2Y(cum)]和預(yù)測(cè)能力[Q2(cum)]分別為0.992和0.944。此外，直線(xiàn)的斜率較大，Q2 的截距為-0.646，說(shuō)明 OPLS-DA 模型沒(méi)有超出擬合（圖 3E）。綜上所述，OPLS-DA模型具有良好的解釋和預(yù)測(cè)能力，能夠真實(shí)反映不同樣本組之間的差異。以上結(jié)果均表明，與23 psu海水相比，3 psu海水條件下青蟹鰓的代謝物發(fā)生了明顯變化。

?篩選差異代謝物

之后研究者通過(guò)多維分析、一維分析和火山圖分析（圖4A），篩選出LS組和CK組之間的差異代謝物。共篩選出LS組519種不同代謝物，其中上調(diào)代謝物288種（表2），下調(diào)代謝物231種（表3）。

圖4 | 差異代謝物篩選

（A）LS和CK組差異代謝物火山圖紅色原點(diǎn)代表顯著上調(diào)的差異代謝物，藍(lán)色原點(diǎn)代表顯著下調(diào)的差異代謝物，灰色原點(diǎn)代表差異不顯著的差異代謝物；青蟹鰓組織中CK和LS的差異代謝物分類(lèi)餅圖：（B）上調(diào)差異代謝物和（C）上調(diào)差異代謝物。

不同代謝物的代謝途徑分析

研究者通過(guò)差異代謝物的代謝途徑富集分析，共得到63條代謝途徑，其中有13條重要的代謝途徑，分別為氨基酸代謝/其他氨基酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝、核苷酸代謝（嘌呤代謝）、膜運(yùn)輸、核苷酸代謝、信號(hào)分子和相互作用，以及脂質(zhì)代謝（圖 5A）。此外還有包括氨基酸代謝/其他氨基酸代謝，碳水化合物代謝等50 個(gè)非顯著富集代謝途徑。從分類(lèi)可以發(fā)現(xiàn)，顯著代謝途徑和非顯著途徑均主要與氨基酸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝有關(guān)。

圖5 | 青蟹鰓組織中適應(yīng)低鹽度的代謝途徑分析

餅圖分類(lèi)：顯著富集（A）和非顯著富集（B）；青蟹適應(yīng)低鹽度的前 20 種代謝途徑的代謝組視圖圖（C）。

通過(guò) GC-MS/LC-MS 進(jìn)行相關(guān)性分析

為了更全面地揭示青蟹對(duì)低鹽度的適應(yīng)代謝機(jī)制，研究者對(duì)GC-MS和LC-MS進(jìn)行了相關(guān)性分析。發(fā)現(xiàn)甜菜堿、?；撬?、天冬酰胺和天冬氨酸等與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的氨基酸出現(xiàn)上調(diào)。并且它們之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。此外，這四種氨基酸與富馬酸、6-磷酸葡萄糖酸、PC(15:0/20:5)、PE(18:2)、PS[O-20:0/18:1(9Z) ]，其他代謝物與 LysoPC(20:4)、LysoPC(18:1)、LysoPC(20:5)、乙醇酸、咪唑丙烯酸等呈正相關(guān)，均下調(diào)，呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（圖6）。

圖6 | 前50種不同代謝物的相關(guān)性分析圖；

相關(guān)性分析圖表示不同物質(zhì)表達(dá)水平之間的相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)。顏色越深，圓點(diǎn)越大，相關(guān)值越高。

相關(guān)分析共篩選出76條通路，其中顯著差異代謝通路28條（P< 0.05)。（圖 7A、C）和 48 條非顯著差異代謝途徑（P < 0.05）（圖 7B）。

圖7 | 青蟹鰓組織適應(yīng)低鹽度的代謝途徑類(lèi)餅圖

相關(guān)討論

文章研究結(jié)果表明，青蟹的滲透壓并沒(méi)有隨著環(huán)境鹽度的下降而持續(xù)下降，證實(shí)了 Na-K-ATPase 和 CA能夠調(diào)節(jié)青蟹滲透平衡。LC-MS非靶向代謝組學(xué)的結(jié)果表明，甘油磷脂可能在青蟹滲透壓調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，而甘油磷脂代謝主要參與磷脂酰膽堿（PC），磷脂酰乙醇胺（PE）、LysoPC和磷酸膽堿的調(diào)節(jié)。在此研究中，PC是上調(diào)最多的磷脂，這表明PC在青蟹的滲透壓調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。GC-MS 和 LC-MS 數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析表明青蟹滲透壓的平衡主要依靠調(diào)節(jié)離子和氨基酸。氨基酸大多以自由擴(kuò)散的方式進(jìn)出細(xì)胞以維持滲透平衡狀態(tài)。此外，一些與糖代謝和能量代謝相關(guān)的重要代謝途徑可能也參與了青蟹滲透壓的調(diào)節(jié)。

研究討論

在這項(xiàng)研究中，研究者運(yùn)用非靶向代謝組學(xué)指出了脂質(zhì)和氨基酸在青蟹適應(yīng)鹽度急速下降中的作用和關(guān)系。首次闡明了通過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)輸發(fā)生的細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)的機(jī)制。這項(xiàng)研究結(jié)果可用于制定應(yīng)急策略，以應(yīng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中鹽分的急劇下降，并改進(jìn)內(nèi)陸低鹽度環(huán)境中的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)。在青蟹的養(yǎng)殖中，在飼料中添加一定量的?；撬岷吞鸩藟A或通過(guò)相關(guān)產(chǎn)物增強(qiáng)代謝途徑，可以提高青蟹適應(yīng)鹽度急速下降的能力。

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鹽度的變化會(huì)影響甲殼類(lèi)動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫力和疾病狀態(tài)。文章作者通過(guò)非靶代謝組學(xué)對(duì)青蟹適應(yīng)鹽度急性下降過(guò)程中的代謝變化進(jìn)行了研究，利用GC-MS 和 LC-MS 數(shù)據(jù)聯(lián)合分析了青蟹應(yīng)對(duì)鹽度急性下降情況的主要代謝途徑。研究結(jié)果表明，在急性低鹽脅迫下，青蟹通過(guò)甘油磷脂代謝物調(diào)節(jié)生物膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，然后通過(guò)ABCs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸氨基酸和碳水化合物，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡。此項(xiàng)研究體現(xiàn)了組學(xué)技術(shù)在機(jī)制研究中的重要作用。

Anger, K., Riesebeck, K., and Püschel, C. (2000). Effects of salinity on larval and early juvenile growth of an extremely euryhaline crab species, Armases miersii (Decapoda: Grapsidae). Hydrobiologia 426, 161–168. doi: 10.1023/A:1003926730312

文末看點(diǎn)｜lumingbio

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